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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2075289

VERFAHREN zur Massenherstellung von Kartoffel-Mikroknollen

VERFAHREN zur Massenherstellung von Kartoffel-Mikroknollen

Name des Erfinders: Hiyuk Yong [KR]; Yang Liu, Riolo [KR]; Yoo Bong-Hong [KR]; Seung-Young Gyun [KR]; Heng-Soon Lee [KR]; Yad Heung John [KR]; Yong-Suk Koo [KR]
Der Name des Patentinhabers: Korea Instityut End of-Science - Technologie (KR)
Adresse für die Korrespondenz:
Startdatum des Patents: 1990.03.07

Verwendung: Landwirtschaft und Biotechnologie. Zusammenfassung der Erfindung: Massenreproduktion Mikroknollen beinhaltet die Induktion von freien Virus mikroklubnegennyh Keime, die Verarbeitung von niedriger Temperatur und Kultur auf einem Nährmedium modifiziert, die Sprossen in flachen Anbau Schiffe zu setzen, auf einem festen Medium für eine Woche im Licht bei 30 ° C und für die nächste beibehalten Wochen im Dunkeln bei 10 ° C und dann bei 6-Stunden - Photoperiode mit Temperaturerhaltung 20 o C während des Tages und 12 o C in der Nacht. Das Verfahren wird unter den obigen Kulturmedien-Formulierungen durchgeführt.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren für die Massenproduktion von künstlichen Pflanzkartoffeln (Kartoffel - Mikroknollen) frei von Krankheitserregern (insbesondere Viren), die die Technik der Kultivierung Pflanzengewebe verwendet.

Kartoffel ist eine Pflanzenart, die zur Familie der Solanaceae gehört und durch vegetative Vermehrung Knollen aus. Eines der schwerwiegendsten Probleme für die meisten kommerziellen Kulturen von vegetativen Vermehrung üblicherweise verfügbar sind, ist die Höhe durch eine virale Infektion, und im Fall von Kartoffel Schäden durch diesen ist ein besonders schwerwiegendes (Manzer FE Merriam DC und Helper PR 1978. Am. Potato Jour zu reduzieren. 55: 601 609. Schultz EG und Bonde R. 1944. Am Kartoffel J. 21 :. 278 283. Wright NS 1977. Am Kartoffel J. 54 :. 147 149. die koreanische Programm von Pflanzkartoffeln: die Organisation, die Auswirkungen der Ergebnisse im Jahr 1987 .. Internationale Kartoffelzentrum. p. 19, 24). Daher die Lieferung von virusfreien Pflanzkartoffeln zu gewährleisten spielt eine entscheidende Rolle technische Kartoffelernteerträge jedes Jahr bei der Lösung.

Es ist bekannt, dass die meisten der viralen Infektion wird durch die Pflanze durch Blattläuse verursacht, die das Virus durch den Mund leicht übertragen können. Deshalb, um es virenfrei Erzeugung von Kartoffelpflanzgut Bereich zu produzieren sollte in den gebirgigen Gebieten befinden, in denen die Bevölkerung von Pflanzen Blattläuse, die das Virus ist sehr gering. Wenn jedoch diese traditionelle Methode der Produktionseffizienz freien Samen Kartoffelvirus mit so gering ist, dass es sehr schwierig ist, eine riesige Menge an Pflanzkartoffeln von guter Qualität zu produzieren, die jährlich benötigt wird.

Vor kurzem aufgrund der schnellen Entwicklung von Pflanzengewebekulturtechniken ermöglicht die Massenzucht von vielen Arten von Pflanzen in vitro-Techniken. Im Falle der Kartoffelzüchtung System des schnellen virenfrei Pflänzchen, die Techniken des Anbaus in Bezug auf Wachstum mit, gut dokumentiert (Goodwin PB Kim YC und Adisarwanto, T. 1980 Potato Res. 23. September 23. Hussey G. und Stacey NJ 1981. Ann. Bot. 48: 787 796. Roset S. und Bokelmann GS 1976 Potato Res 19: 173 178) und wird bereits auf kommerzieller Basis zu einem gewissen Grad verwendet. Jedoch von der Produktionseffizienz hat das obige System mehrere gravierende Nachteile auf, von denen einer in der Tatsache liegt, dass die Transplantation von in vitro Verfahren des Bodens eines Prozesses ist eine Zeit und Arbeit erforderlich ist, die immer intensive Aufmerksamkeit erfordern und somit während dieses Prozesses viele in vitro gekeimt empfindliche Kartoffeltriebe keine plötzlichen Änderungen in der Umgebung standhalten kann.

Seit 1970 gibt es mehrere Berichte über die Bildung von Mikroknollen in vitro Kartoffel, aber die Produktionseffizienz war so niedrig, dass die Forscher das Phänomen der Bildung von Mikroknollen verwendet wurden nur als experimentelles Werkzeug für die Untersuchung der Physiologie der Kartoffelknolle (Garcia-Torres L. und Gomez-Campo C. 1973. Potato . die Res 16: 732 79. Abbott AJ und Belcher AR 1986 Jnplant Gewebekultur und seine landwirtschaftliche Anwendung wortus Butter, S. 113 122. Hussey G. und Stacey NJ 1984. Ann Bot 53: ... 565 578).

Vor kurzem mehrere Versuche und virenfrei guter Qualität Pflanzkartoffeln große Mengen durch Kultivierung von Kartoffel-Mikroknollen in vitro-Kulturverfahren unter Verwendung eines flüssigen Mediums (Wang PJ und HU CY 1982 Amer Kartoffel Jour 59 :. 33 39. Internationale produziert erhalten Patentanmeldung Nummer: PCT / HU 86/00053, 1986). Allerdings ist die Effizienz in der Produktion von Mikroknollen der obigen Verfahren unter Verwendung von noch zu niedrig natürliche Saatkartoffeln zu ersetzen. Darüber hinaus werden die Mikroknollen, die obigen Verfahren in einem flüssigen Kulturmedium erhalten wurden, weisen mehrere entscheidende Nachteile wie einfaches Trocknen bei Lagerung und Mikroknollen häufige Verglasung, ungeeignet künstliche Saatkartoffeln zu machen. Trotz dieser Probleme Mikroknollen Kartoffeln, die bei der Pflanzengewebekultur Kartoffeltriebe ausgebildet sind, kann offensichtlich als eine Möglichkeit verwendet werden, um die Kartoffel des Ersetzens Vegetationspunkte, weil Kartoffel-Mikroknollen sind viel weniger empfindlich und sind leichter in Schritt zu manipulieren Transplantation als bei den durch Züchtung Pflanzengewebe erhalten Sämlinge. Schließlich dank dem charakteristischen Merkmal Pflanzgutmenge erforderlich jährlich so große Kartoffel Mikropropagation, die, auch wenn Mikroknollen seine praktische Bedeutung erweisen sollte, wird der Wert auf Null reduziert, wenn keine Möglichkeit zur Massenproduktion von großen Anzahl von Mikroknollen bei niedrigen entwickeln Fläche und damit ihre Landwirte zu einem niedrigen Preis zur Verfügung stellen, genügend natürliche Saatkartoffeln zu ersetzen.

Daher wird in dieser Erfindung streben wir eine neue Methode für die Massenproduktion von Kartoffel-Mikroknollen zu einem Preis niedrig genug, um zu entwickeln, um sie direkt als echte Bauern Ersatz für natürliche Pflanzkartoffeln zu ermöglichen.

Dementsprechend sind nur einige der Ziele und Vorteile unserer Erfindung, ein neues Verfahren zur Kultivierung von Pflanzengewebe für die Massenproduktion von künstlichen Pflanzkartoffeln (Mikroknollen Kartoffeln), frei von dem Erreger zu entwickeln, die natürliche Saatkartoffeln ersetzen können ist, oder als Ersatz von Pflanzkartoffeln verwendet werden direkt vor der Produktion von natürlichen Saatkartoffeln. Als Ergebnis dieser Erfindung ist es nun möglich wird immer in Massen zu produzieren künstliche Saatkartoffeln, zumindest mehr als 30-mal effizienter als die bereits bekannten Verfahren zur Herstellung von Mikroknollen. Somit dank dieser Erfindung ist es möglich, künstliche Saatkartoffeln zu deutlich ausreichend günstigeren Preis zu produzieren Landwirte als Ersatz für natürliche Pflanzkartoffeln zur Verfügung zu stellen. Weitere Aufgaben und Vorteile unserer Erfindung werden aus einer Betrachtung der Figuren und der detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich werden.

Fig. 1. Cultivating Benotungen Mikroknollen "Superior", die auf künstlichen Nährmedien in einer Petrischale schnell keimen.

Fig. 2. Kartoffel-Mikroknollen grade "Superior", die auf künstlichen Nährmedien in einer Petrischale schnell gebildet.

Fig. 3. Kartoffel-Mikroknollen grade "Superior", die für eine lange Lagerdauer bei einer niedrigen Temperatur in sterile Petrischale aufbewahrt wurden.

Fig. 4. Kartoffeln kurz vor der Ernte, was die Keimung Mikroknollen.

Fig. 5. Der durchschnittliche Ertrag von Kartoffeln aus den Pflanzen geerntet, die von Mikroknollen der Sorte "Superior".

Der gesamte Prozess der Massenproduktion von künstlichen Saatkartoffeln unserer Erfindung ist nur ein paar Schritte. Die folgenden Experimente werden detaillierter veranschaulichen, was tatsächlich Erfindung ist, aber dies bedeutet nicht, dass die Erfindung darauf beschränkt ist.

Versuchsbeispiel 1. Die Grundlage für das Verfahren zur Induktion, Aufrechterhaltung und Massen Keimung Keime Mikroknollen-potato virus frei.

Als Versuchsmaterial ist virenfrei Kartoffelsorten, "Superior", die von der Gartenbauversuchsstation der Entwicklung des ländlichen Raums Verwaltung abgeleitet wird. Dies wurde durch Waschen gereinigt, unter fließendem Leitungswasser, getränkt in 70% Ethylalkohol für 3 min oberflächensterilisiert mit 20 Chlorox (kommerziell) für 10 Minuten, und schließlich in quadratischen Töpfen ausgesät enthält autoklaviert Boden (Vermiculit, Perlit, 1: 1) . Etwa eine Woche Keimung Knoten beginnt , die in einer Wachstumskammer mit 16 Stunden Photoperiode bei einer konstanten Kulturtemperatur beobachtet wird (25 o C).

Zwei Wochen später, als die Sprossen auf eine durchschnittliche Länge von 5 bis 10 cm, Vegetationspunkt (1 2 cm in der Länge) wachsen werden geschnitten und als Basismaterial für das Kulturwachstum Punkte verwendet. Die geschnittenen Sprosse wurden mit sterilem destilliertem Wasser 3 Mal gewaschen und in 70 Ethanol für 30 Sekunden eingetaucht, oberflächensterilisiert mit 10 Chlorox für 10 Minuten, und schließlich auf die flüssige oder feste Medien spezifische Formel beimpft (vgl. Tabelle 1, 2) zum Induzieren und Vermehrung von Keimen, Mikroknollen.

Umweltbedingungen für die Wachstumskammern waren zu diesem Zeitpunkt gleich die Bedingungen der Mutterknolle Keimung. Eine Woche nach der in dieser gleichen Außenkulturbedingungen axillären Sprosse Aussaat beginnen zu erscheinen, und in den meisten Fällen nach 3 4 Wochen wachsen sie so schnell wie für die Subkultur erforderlich. Zugleich gelten Züchtungstechniken Schichtung maximale Induktion von Achseltriebe zu stimulieren, aber im Fall von Schiffen oder Reagenzgläser Technik erfordert viel Einfallsreichtum, dass in diesem Experiment Triebe in flache Petrischalen (Durchmesser 10 cm kultiviert wurden, Höhe 1 5 cm), wodurch in vitro Fortpflanzung erhalten automatisch, was zu einem deutlichen Anstieg in der Anzahl der axillären Sprosse (siehe. Tabelle 3). Im Allgemeinen ist die Wachstumsrate von Trieben in flüssigem Kulturmedium in einem festen Medium überlegen Wachstumsrate von Sprossen kultiviert werden. Aber wenn Subkultur für einen langen Zeitraum in einem flüssigen Medium blieb traten häufig Keime Degeneration oder Verglasen durch übermäßige Absorption von Feuchtigkeit verhindert das normale Wachstum der Kartoffeltriebe in vitro. Als Ergebnis nur mit der Anfangsphase des flüssigen Kulturmediums und dann hauptsächlich festes Nährmedium verwendet.

Es wird darauf hingewiesen, dass die Tatsache, dass nicht alle Triebe auf künstlichen Nährmedien vermehrt, in der Lage sind, Mikroknollen zu bilden, wenn für die Bildung der Mikroknollen zu der nächsten Stufe bewegt, sondern schießt nur mit einzigartigen Eigenschaften, mit anderen Worten mit einem leicht verlängerten Internodien mit nicht-Stamm Blätter mit starken Wurzeln und Sprossen besonders an den Enden Niere schießt (siehe. Fig. 1) sind in der Lage Mikroknollen in großen Mengen zu bilden (siehe. Tabelle 5). Deshalb nannten wir Sprossen mit einer solchen spezifischen Eigenschaften wie "Sprossen Mikroknollen" und haben in der koreanischen Type Culture Sollection als proprietäre Pflanzenzelllinien ( "Superior", eine proprietäre Linie 8445 N p-Zellen) registriert und abgeschieden. Solchen Kartoffel-Mikroknollen geben Keime ausschließlich auf dem Induktionsmedium zur Bildung von Mikroknollen spezifischen Zusammensetzung und wird einmal gebildet sind, behalten sie ihre Eigenschaften auch nach mindestens 24 aufeinander folgenden Einzelkultivierungs Jahr.

Experimentelles Beispiel 2. Verfahren zur Massenproduktion von Kartoffel-Mikroknollen.

Sprossen Mikroknollen unter proliferate in Experimental 1 dargestellten Beispiel wurde zuerst in einen Hochtemperaturgefäßwachstum (30 o C) (andere Kulturbedingungen identisch mit den zuvor genannten Medien proliferieren Mikroknollen - Triebe) für eine Woche überführt und wurden dann in eine Tieftemperatur (10 o C) Wachstumskammer in völliger Dunkelheit für eine weitere Woche. Nach dem Tieftemperaturbehandlung wurden die Keimlinge Mikroknollen auf Induktionsmedium ausgesät Mikroknollen zu bilden (siehe. Tabellen 2 und 4), dicht zaplavleny Paraffin und kultiviert in einer Wachstumskammer , wo die Tagestemperatur bei 20 ° C und einer Nachttemperatur gehalten wurde bei 12 ° C gehalten wurde , , während der Lichtperiode betrug 6 Stunden Licht und 18 Stunden Dunkelheit. Die Lichtintensität betrug etwa 500 Lux. Um den Raum der Wachstumskammer voll zu nutzen, gestapelte die Petrischalen wir so viel wie möglich. In den meisten Fällen nach etwa 10 Tagen wurden sie zum Induzieren von Mikroknollen zu solchen Bedingungen übertragen, die pro Schale Mikroknollen Kartoffel beginnt und nach 40 bis 50 Tage Kulturperiode gebildet Mikroknollen, so klein wie Sojabohnen in einer Menge von mehr als 10 Einheiten im Mittel zu bilden Petri. (Siehe. Abb. 2).

Wenn sie bei einer Konzentration von 50 ppm zum Wachstum Nährmedien Wachstumshemmers wie phosphon D, Amo 1618, B-905 (N-dimethyl-Bernsteinsäure aminopoluamid) und Cholinchlorid Chloro (XXX) zugegeben. Mikroknolle Produktionseffizienz signifikant erhöht wird.

Bei der Sorte "Superior" eine vergleichende Studie in Bezug auf die Effizienz der Produktion pro Raumeinheit Kultivierung ein Gefäß, das den Unterschied der Ergebnisse zwischen den traditionellen Art und Weise der Kultivierung in einem Gefäß mit flüssigen Nährmedium mit nemikroklubenkovyh Keime und Methode des Anbaus auf einem festen Medium in einer Petrischale angegeben ein mit Mikroknollen-Keime, die in dieser Erfindung mit allen anderen Behandlungen entwickelt, um die Rate der Induktion von Mikroknollen zu erhöhen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 und Tabelle 7 gezeigt.

Experimentelles Beispiel 3. eine längere Lagerung von Kartoffel-Mikroknollen Verfahren und Methoden zur Hemmung der Keimung und während der Lagerung zu stimulieren.

Mikroknollen grade "Superior" in Petrischalen quantitativ erhalten aseptisch mit sterilem destilliertem Wasser 3 oder 4 mal gesammelt, gewaschen, damit aus dem Kulturmedium auf der Oberfläche verbleibenden reinigen. Dann breitete sie aus und in einem sauberen Rack getrocknet, bis die Feuchtigkeit vollständig von der Oberfläche entfernt wird. Nach dem Trocknen wurden die Mikroknollen leere sterile Petrischalen setzen in und fest mit drei Schichten aus Wachsfolie verschlossen und bei einer niedrigen Temperatur von 4 ° C im Kühlschrank aufbewahrt (siehe. Fig. 3). Nach etwa zwei Monaten in einem Kühlschrank Rest Altern und keimten dann leicht brechen, bei Raumtemperatur oder zwei Wochen zu verlassen oder so, falls erforderlich (siehe. Tabelle 8). Wenn es erforderlich ist, sie für eine lange Zeit ohne Keimung zu erhalten, wurden sie mit einer Lösung von mg / l Abscisinsäure 5 für 3 Stunden vorbehandelt vor der endgültigen Lagerung bei niedriger Temperatur. Auf diese Weise möglich, Mikroknollen bei gesunden Bedingungen für mehr als ein Jahr zu sparen, wurde noch nicht bestätigt, dass er die Fähigkeit zu keimen oder geschadet verloren hatte (siehe. Tabelle 9). Wenn es gewünscht wird Keimung bald nach der Ernte zu erhalten, ist es möglich, leicht Keimung Störung durch Behandlung von Gibberellinsäure Behandlung oder zusammen mit einem warmen Wasserbad bei 38 ° C Säurebehandlung zu Gibberellic (siehe. Tabelle 8). Diese Art der Behandlung gibberellinom und hoher Temperatur wurde auch die Frist für die Keimung im Fall von Mikroknollen, deren Frieden gebrochen hat zu reduzieren (siehe. Tabelle 10).

Experimentelles Beispiel 4. Testausgang Mikroknollen Kartoffelsorten, "Superior".

Wir führten eine Kontrollexperiment die Ernte zu vergleichen gewachsen mit natürlichen herausnehmbaren Kartoffeln mit Getreide mit Hilfe von Kartoffel-Mikroknollen angebaut. Wenn die Länge der Sprossen keimender Mikroknollen 2 bis 3 Länge nach Behandlung zur Keimung mm erreicht als 3 in dem experimentellen Beispiel beschrieben, wurden Mikroknollen ausgesät direkt auf dem Boden. In einem frühen Stadium Mikroknollen Wachstum war relativ schwach im Vergleich zum Wachstum der natürlichen herausnehmbaren Kartoffeln, aber nach der Mitte der Bühne, sie zeigten ein sehr schnelles Wachstum und zum Zeitpunkt der Ernte, 3 Monate nach der Mikroknollen des Bodens erhöht um zwei Drittel höher als die natürliche Saatkartoffeln Einpflanzen . Die Endausbeute pro Pflanze und zeigt in etwa den gleichen Anteil wie die Wachstumsrate des Bodens. Pflanze abgeleitet von Mikroknollen produziert etwa 507 g Kartoffeln pro Pflanze, während die natürlichen Saatkartoffeln von etwa 812 g pro Pflanze (siehe. Tabelle 11 in Fig. 4 und Fig. 5). Mit anderen Worten wurden die durchschnittliche Rendite von Kartoffel-Mikroknollen erreicht etwa 60 bis 70% der natürlichen Pflanzkartoffeln angebaut, wenn die gleiche Art und Weise wie natürliche Pflanzkartoffeln. Da jedoch die Pflanzen von Mikroknollen abgeleitet waren viel kleiner als die Pflanzen aus natürlichen Saatkartoffeln abgeleitet, ist es offenbar möglich, dass eine enge Passung um den Ertrag pro Acre zu erhöhen.

FORDERUNGEN

1. Verfahren zur Massenproduktion von Kartoffel-Mikroknollen, die Induktion von Virus-freien Spezies mikroklubnegennyh Keime "Supfior" auf Mikroknollen-Induktionsmedium, Keime mikroklubnegennyh Verarbeitung bei niedriger Temperatur und behandelten Keime auf modifizierte mikrorostkov Induktionsmedium mit weiteren Wachstumsinhibitor Kultivierung zu erhalten mikrorostkov dadurch gekennzeichnet, dass ein Induktions mikroklubnegennyh Keime und Empfangen von Mikroknollen auf festem Medium, in den gestapelten bzw. Gefäße flachen Petrischalen enthalten, Sprossen für 1 Woche im Licht bei 30 ° C und in der nächsten Woche im Dunkeln bei etwa 10 ° C inkubiert und Mikroknollen durch Züchtung erhalten die Triebe für 6 Stunden bei 20 ° C im Licht und 18 Stunden bei 12 ° C im Dunkeln gealtert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet mikroklubnegennye Triebe auf festes Medium induzieren mit der folgenden Zusammensetzung in mg / l:

  • Ammoniumnitrat 2000
  • Kaliumnitrat 2500
  • Calciumchloriddihydrat 440
  • Magnesiumsulfat-heptahydrat 370
  • Kaliumphosphat 170
  • Natrium-EDTA 37.25
  • Eisensulfat Heptahydrat 27,85
  • Mangansulfat-Monohydrat 16,9
  • Borsäure 6.2
  • Zinksulfat-Heptahydrat 8,6
  • Kaliumiodid 0,83
  • Natriummolybdatdihydrat 0,25
  • Kupfersulfatpentahydrat 0,025
  • Kobaltchlorid-Hexahydrat 0.025
  • myo-Inosit 100
  • Ascorbinsäure 50
  • Gibberellinsäure 0,1
  • Zeatinribosid 0,1
  • Sucrose 20000
  • Agar 10000
  • Cyanocobalamin 1.5
  • Folsäure 0,5
  • Riboflavin 0,5
  • Biotin 1
  • Cholinchlorid 1
  • Calciumpantothenat 1
  • Thiamin-Hydrochlorid Salz 1
  • Nicotinamid 2
  • Pyridoxin HCI 2
  • Parabens 0,5

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroknollen auf festem Medium hergestellt mit der folgenden Zusammensetzung in mg / l:

  • Ammoniumnitrat 1000
  • Kaliumnitrat 1500
  • Calciumchloriddihydrat 440
  • Magnesiumsulfat-heptahydrat 370
  • Kaliumphosphat 500
  • Na 2 EDTA 37,25
  • Eisen Ferrosulfatheptahydrat 27,85
  • Mangansulfat-Monohydrat 16,9
  • Borsäure 6.2
  • Zinksulfat-Heptahydrat 8,6
  • Kaliumiodid 0,83
  • Natriummolybdatdihydrat 0,25
  • Kupfersulfatpentahydrat 0,025
  • Kobaltchlorid-Hexahydrat 0.025
  • myo-Inosit 100
  • Zeatinribosid 0,1
  • Ascorbinsäure 50
  • Hlorholinhlorida oder phosphon D, Amo-oder 1618 oder B-905100
  • Sucrose 90
  • Agar 10
  • Cyanocobalamin 1.5
  • Folsäure 0,5
  • Riboflavin 0,5
  • Biotin 1
  • Cholinchlorid 1
  • Calciumpantothenat 1
  • Thiamin-Hydrochlorid Salz 1
  • Nicotinamid 2
  • Pyridoxin HCI 2
  • Parabens 0,5 °

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Erscheinungsdatum 06.03.2007gg