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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2088938

Verfahren zum Nachweis von Darmdysbiose und Darminfektionen

Verfahren zum Nachweis von Darmdysbiose und Darminfektionen

Name des Erfinders:. Bucharin OV; Valyshev AV. Zykov LS. Sitzen ist Konnova. Sokolov VY. Chelpachenko OE
Der Name des Patentinhabers: Orenburg Abteilung Persistenz von Mikroorganismen Institut für Ökologie und Genetik von Mikroorganismen, Ural Abteilung der Russischen Akademie der Wissenschaften
Adresse für die Korrespondenz:
Startdatum des Patents: 1993.07.01

Ein Verfahren zur Darmdysbiose und Darm-Infektionen zu erkennen. Verwendung: im Bereich der medizinischen Mikrobiologie, nämlich in der Labordiagnostik von Darmerkrankungen Mikrobiozönose. Die erfindungsgemäße in auf Nähragar gezüchtet Ermitteln von Kolonien fäkale Enterobakterien Fähigkeit, eine kommerzielle Herstellung von menschlichem Leukocyten-Interferon in einer Konzentration von 2 IBC für Testkultur Corynebacterium xerosis GISCO N 181. In diesem Fall ist der Mangel an Aktivität in antiinterferonovoy Kolonien anzeigt eubioz zu inaktivieren Plattieren; Merkmalerfassungs bei 1-50% der Kolonien anzeigt Darmdysbiose, während die Anwesenheit eines Merkmals in 50% der Kolonien - auf Darminfektion. Das Verfahren ermöglicht es, eine frühzeitige Diagnose von Darmdysbiose und Darminfektionen durchzuführen, indem die Zeit verringert und informativer Studien durch Vororientierung Bewertung des Zustands der Darmflora. Das Verfahren kann verwendet werden, Massen-Screening durchzuführen, Hochrisikogruppen, und für die Differenzialdiagnose verschiedener Darm Bedingungen Mikrobiozönose in komplexen klinischen und bakteriologischen Situationen zu identifizieren.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, insbesondere der medizinischen Mikrobiologie und kann zur Diagnose von Darmdysbiose und Darminfektionen verwendet werden.

In den letzten Jahren überall gibt es einen signifikanten Anstieg in der Häufigkeit von Darmdysbiose (dysbiosis), die eine Quelle von akuten endogene Infektionen (Peritonitis, Appendizitis, Cholezystitis, Pyelonephritis, Pneumonie), trägt es zur Entwicklung von allergischen Erkrankungen, die Bildung und Progression von chronischer Entzündung in verschiedenen Organen. Darmflora mit Darmdysbiose spielt eine Rolle in der Karzinogenese, Atherosklerose, ist eine Quelle von Antibiotikaresistenzgenen, die auf andere Bakterien übertragen werden können.

Aufgrund der hohen Prävalenz von Darmdysbiose Frage der rechtzeitige Anerkennung seiner eine der Aufgaben des Diagnose-Service zu werden. Zu Darmdysbiose erkennen sind bekannt erweitert bakteriologische Untersuchung von Fäzes mit einer bestimmten Menge in der klassischen Art und Weise zu verwenden, und biologische Eigenschaften des anaeroben Mikroflora (Epstein-Litvak RV und anderen bakteriologischen Diagnostik von Darmdysbiose: .. Richtlinien M. 1977). Extreme Vielfalt der Darmflora (in den Blinddarm Inhalte sind Vertreter von 17 Familien, 45 Gattungen und mehr als 400 verschiedene Arten) eine große Menge von Kulturmedien und die Schaffung von besonderen Bedingungen für die Kultivierung von Mikroorganismen erfordert. Dies führt zu der Tatsache, dass Darmdysbiose labordiagnostischen Verfahren bisher sind teuer, arbeitsintensiv, zeitaufwendig und nicht akzeptabel für die Massenforschung.

Basierend auf dem Vorstehenden kann über die Bedeutung der Früherkennung von Darmdysbiose für die rechtzeitige und wirksame Durchführung der Korrektur der Mikroflora und biologischen Immunopreparat abgeschlossen werden. Zur Lösung dieses Problems erfordert Bevölkerung Screening-Programme für Darmdysbiose.

Da die Verletzung der Darm ökologischen Gemeinschaft alle Eigenschaften der Mikroflora (antagonistischen und Vitamin ende Aktivitäten, die Teilnahme an Stoffwechselprozessen und andere.) Stark variieren, bot eine Vielzahl von indirekten diagnostischen Tests von Darmdysbiose. Somit werden die Zustands Mikrobiozönose durch die Höhe der Metaboliten der Darmflora beurteilt. Zu diesem Zweck definieren indican, p-Kresol und Phenol im Urin; Wasserstoff und Methan in der ausgeatmeten Luft; flüchtigen Inhalt Fettsäure in der jejunal oder Fäkalien; Ammoniak im Blut im Stuhl oder in der ausgeatmeten Luft (AO Tamm et al. Metaboliten bei der Diagnose von Darm Darmdysbiose. Antibiotika und medizinische Biotechnologie. 1987, Bd. 32, N 3, s.191-195). Verfahren zum Nachweis von Darmdysbiose, auf dem Nachweis von Stoffwechselprodukten basiert, zufriedenstellende Ergebnisse in schweren Ungleichgewichts der Darmflora und geringe Empfindlichkeit und diagnostischen Wert in der Anfangsstufe der Darmdysbiose haben (ibid, p. 192). Daher sind diese Verfahren nicht ausreichend für Populationen Darmdysbiose Screening. Die Grundlage einer anderen Methode Verletzungen zu identifizieren dysbiotischen stellen den Grad der antagonistische Aktivität der aus dem Kot isoliert Mikroorganismen (Zavgorodnyaya EF et al. Die antagonistische Aktivität der Darm autoflora als indirekte Methode zum Nachweis von Darmdysbiose. Physician Job. 1981, N 6, s.113-116) . Der Nachteil dieser Methode der Darmmikroflora Zustand der Beurteilung ist Dauer-Studie (Tag 5).

Im Zusammenhang mit den oben genannten Umständen die Suche nach neuen Screening-Verfahren für Darmdysbiose ist eine dringende Aufgabe für klinische Mikrobiologie. Während der Masse der Bevölkerung, vor allem die Untersuchungen der Kinder, Darmdysbiose von erheblicher Bedeutung zu identifizieren, ist die Differenzierung der letzten sporadische Fälle von Darminfektionen. Derzeit gibt es keine klaren klinischen und mikrobiologischen Kriterien für diese beiden Erkrankungen unterscheiden. Bestehenden Labordarminfektionen diagnostische Methoden, die durch opportunistische Enterobakterien (PEO) Escherichia, Proteus, Klebsiella und anderen. Auf der Basis der Detektion desselben in einer Menge von nicht weniger als 10 CFU Juni in 1 g Fäkalien, die Bewertung ihrer biologischen Eigenschaften, die Anwesenheit von Antikörpern gegen opportunistische Enterobakterien in Titer 01.40 oder höher mit einem Anstieg ihrer Ebenen in der Dynamik der Krankheit in der Studie von "gepaart" Seren (Queen LB et al. die Klinik, Diagnose, Behandlung, Epidemiologie und Kontrollmaßnahmen im Falle einer akuten Darm durch opportunistische Bakterien verursacht Infektion bei Säuglingen: Richtlinien, M. 1988, S. 19). Die hohen Kosten, Arbeitsintensität, schließt der Studiendauer die Verwendung dieser Verfahren zur Diagnose von Darminfektionen, die durch PEO verursacht wird, für das Screening. Daher wird eine besondere Aktivität, ein Verfahren zur bakteriologischen Screening zu entwickeln, die erste Stufe der Prüfung (Suchprogramm) ermöglicht zu identifizieren und eine Differentialdiagnose der häufigsten infektiösen Darmerkrankungen Darmdysbiose und Darminfektionen durch opportunistische Bakterien verursacht auszuführen.

Die nächstgelegene technische Lösung als Prototyp gewählt wird, ist ein Verfahren zur Bestimmung Darmdysbiose Defizit von Bifidobakterien (seeding Suspension von Fäkalien in Umgebung Blaurock produziert, durch Mikroskopie Buchhaltung, Gram-gefärbten hergestellt Ausstrichen von typischen Kolonien) und die Erkennung von Gewebeprotein in den Fäzes (Ablagerung von löslichen Proteins durch die Zugabe von Trichloressigsäure zu der Emulsion von Fäkalien, Buchhaltung Grad Sichtkontrolle gebleichtem Überstand), was auf eine mögliche Beschädigung der Zellelemente der Darmwand (Dorofeychuk VG usw. die wichtigsten Tests für Darmdysbiose. Pristendovy Blatt VDNKh Moskau 1991. ). Der Nachteil dieses Verfahrens ist der Mangel an Darmdysbiose Diagnose in einem frühen Stadium, nur geringe Änderungen im aeroben Teil Mikrobiozönose (Zunahme oder Abnahme in der Anzahl von E. coli in Abwesenheit von Reduktions das Niveau der Bifidobakterien 1 Grad dysbiosis) charakterisiert (Grachev, N. et al. Die Verwendung von bakteriellen biologischen Agenzien in der Praxis der Behandlung von Patienten mit Darminfektionen Diagnose und Behandlung von Darmdysbiose: .. Richtlinien M. 1986, S. 16-17) .. Darüber hinaus bedeutet die visuelle Beurteilung ( "vollständig", "groß", "klein" gebleichten Flüssigkeit), die nicht objektiv zu bewerten und die Ergebnisse zu standardisieren.

Die vorstehende verallgemeinerte Beschreibung der identifizierten Methoden Analoga mit den Gründen, die die Herstellung des erforderlichen technischen Ergebnis zu verhindern gibt Anlass zu dem Schluss, dass die beanspruchte Erfindung nicht aus dem Stand der Technik bekannt ist, das heißt, Es ist neu.

Der große Unterschied ist, dass ermittelte antiinterferonovuyu Aktivität gleichzeitig in allen Kolonien von Enterobacteriaceae in Kot auf Nähragar mit einer Präparation von Human-Leukozyten-Interferon in einer Konzentration von 2 IBC für die Testkultur Corinebacterium Xerosis GISCO N 181 und Inaktivierung Kolonien Interferon schließen über den Zustand des Darm Mikrobiozönose Aussaat : antiinterferonovoy Mangel an Aktivität in den Kolonien zeigt eubioz; Merkmalerfassungs bei 1-50% der Kolonien anzeigt Darmdysbiose, während die Anwesenheit eines Merkmals in 50% der Kolonien auf Darminfektion.

Die Autoren schlagen vor, dass erhebliche Unterschiede neu sind und die Gelegenheit bieten, eine frühzeitige Diagnose von Darmdysbiose und Darminfektionen implementieren, indem die Zeit verringert und informativer Studien durch Vororientierung Bewertung des Zustands der Darmflora. Das erfindungsgemässe Verfahren kann verwendet werden, Massen-Screening durchzuführen, Hochrisikogruppen, und für die Differenzialdiagnose verschiedener Darm Bedingungen Mikrobiozönose in komplexen klinischen und bakteriologischen Situationen zu identifizieren.

Das Verfahren ist wie folgt.

Rectal loop ausgesät Inhalt des Rektums in die Petrischale mit 1,5% Fleisch-Pepton-Agar Herstellung von Human-Leukozyten-Interferon enthaltende (NGO "Immunopreparat", UFA) in einer Menge von 0,3 ml Arbeitslösung 7,5 ml Agar was zu einer Konzentration von 2 MBC Testkultur Corynebacterium xerosis GISCO N 181. die Arbeitslösung entspricht, wird nach den Anweisungen des Lösungsfläschchen in 2 ml steriler 0,85% Natriumchloridlösung. Zur gleichen Zeit, eine Tasse kann Kot Sektor aus zwei oder drei Themen werden Aussaat. Die Kulturen wurden bei 37 ° C Kolonien sauber Paare von Chloroform in einem Inkubator für 18-24 Stunden inkubiert. Zu diesem Zweck wird die Tasse hält den Kopf, steckte es in ein Stück Papier Whatman eine Fläche von 8-10 cm 2 und imprägniert decken mit ihren 0,3-0,5 ml Chloroform. Halten Sie geschlossene Schale für 20-30 Minuten. Drehen Sie den Becher oben auf den Kolonien und 4,3 ml weichen laminiert (0,6-0,7%), Agar, gemischt mit 0,1 ml Suspension (in etwa 1 ml am 10. September Indikatorzellen durch einen optischen Trübungsstandard) täglich Agar Testkultur Corynebacterium Xerosis GISCO N 181.

Die Ergebnisse wurden nach 18-24 h Inkubation in einem Thermostaten bei 37 ° C, bewertet d.h. nach zwei Tagen nach Beginn der Studie. Nach der Inkubationszeit der Aktivität antiinterferonovuyu Plattieren von Fäkalien auf das Wachstum des Teststammes auf der Oberfläche und um die Kolonien zu bestimmen, die anzeigt, dass die Probleme im Darm Mikrobiozönose. Der Nachweis antiinterferonovoy Aktivität in 1-50% der Kolonien zeigt Darmdysbiose; es gibt keinen Beweis von mehr als 50% der Kolonien Darminfektion anzeigt, und das Fehlen von Zeichen auf eubioz.

Basierend auf den Ergebnissen von Erwachsenen und Kindern befragt Suchprogramm wegen des Verdachts der Darmdysbiose oder Darm-Infektion in der Zahl kann antiinterferonaktivnyh Kolonien bestätigt angesehen werden. Das Hauptprogramm in der zweiten Stufe der Diagnose Suche zusätzlich zu der Suchmaschine verwendet, müssen Sie bakteriologische Untersuchungen von Kot einzusetzen, um die Art und den Grad der Darmdysbiose, die Form (ehsherihioza, klebsiellez et al.) Darm-Infektion und eine Entscheidung über die Methoden ihrer Korrektur zu klären.

Theoretischer Hintergrund zur Entwicklung des vorgeschlagenen Verfahrens zum Nachweis von Darmdysbiose und Darminfektionen gedient haben wir Unterschiede in der Zahl antiinterferonaktivnyh Kolonien gefunden auf Agar-Kulturen Kot von gesunden Probanden und Patienten mit Darm-Dysfunktion (Tabelle. 1).

Also, wenn Fäkalien von 30 Patienten mit Darm-Infektion verursacht durch EPKP 0,18, nicht typisierbaren Escherichia, Klebsiella, Proteus, und andere Enterobakterien, in 28 Fällen (93,3%) der Aussaat wurden antiinterferonaktivnye Kolonie gefunden. Für diese Gruppe von Patienten schien antiinterferonovoy durch Aktivität in den meisten (80-100%) Kolonien aus.

Wenn isparazhneny von 100 Patienten mit Darmdysbiose antiinterferonovogo positiven Ergebnisse des Tests der Aussaat wurden mit der gleichen Frequenz (87% der Patienten), sowie Darm-Infektionen identifiziert. Jedoch antiinterferoaktivnyh entfielen 1-50% der Kolonien, also weniger als die Hälfte auf der Schale gezüchtet.

Die Untersuchung klinisch und bakteriologisch 30 gesunden Kindern und Erwachsenen in den 27 Fällen (90%) in der Beschichtung von Fäkalien wurden Kolonien Inaktivierung des Interferon nachgewiesen. Nur 3 von 30 befragten antiinterferonovy positiven Test, und die Anzahl der aktiven Kolonien betrug 3-5% des gezüchteten identifiziert.

Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurde eine Screening-Studie von 140 Kindern von somatischen Krankenhaus CSS PO "Strela" Orenburg Kinder über einen längeren Darm-Dysfunktion durchgeführt. Ergebnisse sind in Tabelle gezeigt. 2.

Bei der Verwendung der beanspruchten Prozesskriterien (antiinterferonovoy Aktivität in Gegenwart von 1-50% der Kolonien) für positive Darmdysbiose in 22 Fällen von 180 (12,2%) festgestellt Screening, während Prototyp-Verfahren (Erkennung von Proteingewebe in Abwesenheit von Fäzes Bifidobakterien) in 10 Fällen (5,6%), P <0,05.

In der Gruppe der Kinder mit Darmdysbiose positive Screening-Ergebnisse wurden durch bakteriologische Untersuchung von Kot bestätigt eingesetzt wie in RV beschrieben Epstein-Litvak FL Vilshanskoy (1977).

Patienten mit positivem Testergebnis für Darm - Infektion Diagnose wurde durch bakteriologische Verfahren (Nachweis von PEO in Reinkultur aus der Zucht Kot 10 -5, die der Anzahl ihrer mehr 10. Juni CFU in 1 g entspricht) bestätigt und eine positive Immunantwort des Wirts - die Anwesenheit von Serum SEA Antikörpertiter von 1: 160 und höher.

Die Methode wurde verwendet, um drei Gruppen von Kindern zu untersuchen: die erste - Patienten mit Darmdysbiose; Zweitens Patienten mit Darminfektionen; dritte Kontrolle. Hier sind einige Beispiele.

Die erste Gruppe von Kindern (Patienten mit Darm disbizom).

Beispiel 1. Patient C 10 Jahren. Die Diagnose über die Zulassung chronische Pyelonephritis esherihioznoy Ätiologie in akuten Stadium. Während der Vorführung des vorgeschlagenen Verfahrens nachgewiesen Darmdysbiose (die Anzahl der Kolonien, wenn antiinterferonaktivnyh Kot überzogen war 15%), während eine parallele Umfrage auf einem Prototyp Stuhl dysbiotischen Phänomene durchgeführt wurde nicht gefunden. In weiterer üblicher Weise Verletzung intestinalen Mikrobiozönose validiert als die Gesamtzahl von E. coli (4,6 · 10 September CFU / g) c hämolytischen Aussehen und laktose Formen (8 und 20%) und eine Reduzierung bifidoflora Erhöhung (7. Oktober cfu / g). Verbringen Sie eine gezielte Darmflora Korrektur Biologics. Folglich diagnostiziert das vorgeschlagene Verfahren bei einem Patienten Darmdysbiose in der frühen Phase der Untersuchung, die die Korrektur von Verletzungen zu führen erlaubt und die Anzahl der Schübe von Pyelonephritis zu reduzieren.

Beispiel 2. Patient R. 8 Jahre. Er leidet an Neurodermitis seit dem Alter von drei. Die bakteriologische Untersuchung von Kot vorgeschlagenen Verfahren nachgewiesen 30% der Kolonien, die Interferon inaktivieren. Zeichen erkannt Verstoss gegen dysbiotischen weitere detaillierte Analyse durch einen Mangel an Bifidobakterien (10 5 KBE / g) und Escherichia (6. Oktober KBE / g), Erhöhung des Gehalts an PEO Klebsiella (10. Juli KBE / g).

Die zweite Gruppe von Patienten (Patienten mit Darminfektionen).

Beispiel 1. Patient M. von 2 Monaten. Aus der Geschichte wissen wir, dass das Kind an seine Brust am dritten Tag nach der Geburt (postnatalen Blutungen bei der Mutter) befestigt ist. Nach der Entlassung aus dem Krankenhaus Stuhl beschleunigt bis zu 8-10 mal mit Schleim. Füttern natürlich. Hinter der Masse (Anstieg von 1 850 g pro Monat, für die zweite 300 g). Bei der Untersuchung ergab Anzeichen von Unterernährung 1 Grad. Hocker 2-3 mal pro Tag, die Flüssigkeit ohne pathologische Verunreinigungen. Antibiotika werden nicht behandelt. In der Studie der über die Zulassung durchgeführt vorgeschlagene Methode Fäkalien ergab antiinterferonovaya Aktivität bei 100% Beimpfung fäkale Kolonien auf Nähragar Leukozyten-Interferon, das anzeigt, dass Darm-Infektionen. Weitere klinische und bakteriologische Untersuchung bestätigte das Vorhandensein von Darminfektion esherihioznoy: enterpatogennaya ergab E. coli der Serogruppe 018 in einer Menge von 6,3 h 10 9 cfu / g mit schwach exprimiert enzymatischen Eigenschaften. Gezielte Antibiotika-Therapie in Kombination mit Krankheitserregern hat zu einem positiven Effekt geführt.

Beispiel 2. Patient G. 7 Jahre. Beschwerden von low-grade Fieber, Durchfall für zwei Tage nach getrockneten Früchten zu essen. Im Verlauf der klinischen und Laboruntersuchung des vorgeschlagenen Verfahrens in zwei Tagen nach dem Eingang der Set Darm-Infektion, die durch das Vorhandensein von Fäkalien in der Kultur bei 80% der Kolonien Fähigkeit Interferon zu inaktivieren gerechtfertigt ist. Anschließende Untersuchung zeigte nichttypisierbare Escherichia in einer Menge von 2,1 Teilen 10. September cfu / g, hämolytisch inaktives und einen vierfachen Anstieg der Antikörpertiter E. coli in der zweiten Woche der Krankheit autostrains.

Eine dritte Gruppe von Kindern (Kontrolle).

Beispiel 1. Ein Kind 5 Jahre. Die Diagnose über die Zulassung Enuresis. Während der Screening für Darm-Beschwerden in Mikrobiozönose ein negatives Ergebnis antiinterferonaktivnyh Kolonien wurden in der Ernte von Kot gefunden. Eubioz Eingesetzt durch bakteriologische Analyse bestätigt.

Beispiel 2. Boy O. 6 Jahren. Im Alter von 5 Jahren betrieb er für Stenose prilohanochnogo Harnleiter auf. Die postoperativen Phase wurde durch Pseudomonas-Infektion der Harnwege kompliziert. Finden der Quelle der Infektion der Harnwege mit Fäkalien auf dem vorgeschlagenen Verfahren untersucht. Ein negatives Ergebnis. Die bakteriologische Untersuchung von Kot bestätigt eubioz. Harnwegsinfektion durch Pseudomonas aeruginosa war das Ergebnis von nosokomialen Infektionen. Die Anwendung von Pseudomonas-Phagen führte zur Reorganisation des Harntraktes.

So führte die mikrobiologische Forschung und klinische Studien haben gezeigt, dass das vorgeschlagene Verfahren hat die folgenden Vorteile: leicht zu testen, erschwinglich, nicht-invasive, keine speziellen Einrichtungen und Ausrüstungen erfordern, wie zum Stand der Technik im Vergleich verbessert die Genauigkeit der Diagnose in der Hälfte, reduziert die Dauer der Studie für einen Tag. Die Möglichkeit, wiederholt, sogar täglich Analysen und ein Vorteil des Verfahrens.

FORDERUNGEN

Verfahren zum Nachweis Darmdysbiose und Darminfektionen, die durch auf einem Medium, welches das Testmaterial Inokulation, wobei das Bestimmen antiinterferonovuyu Aktivität gleichzeitig in allen Kolonien Enterobacteriaceae Plattieren von Fäkalien auf Nähragar mit einer Zubereitung von menschlichem Leukozyten-Interferon in einer Konzentration von 2 MBC für Testkultur Corynebacterium xerosis GISCO N 181 und in der Inaktivierung von Kolonien, die auf den Zustand der intestinalen Mikrobiozönose Interferon schließen: antiinterferonovoy Mangel an Aktivität in Kolonien zeugen eubioz; Merkmalerfassungs 1-50% der Kolonien zeigt Darmdysbiose, während die Anwesenheit eines Merkmals in 50% der Kolonien auf Darminfektion.

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Erscheinungsdatum 30.03.2007gg