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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2104526

Verfahren zur Diagnose von T-Zell-Lymphom Haut

Verfahren zur Diagnose von T-Zell-Lymphom Haut

Name des Erfinders: Kogan Emmanuel Markovic; Zhukotsky Alexander; Kopylov Viktor Fjodorowitsch; Lezvinskaya Elena; Läufer Sergey
Der Name des Patentinhabers: Kogan Emmanuel Markovic; Zhukotsky Alexander; Kopylov Viktor Fjodorowitsch; Lezvinskaya Elena; Läufer Sergey
Adresse für die Korrespondenz:
Startdatum des Patents: 1995.05.05

Verwendung: Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, und zwar in der Dermatologie und Hämatologie, die für eine frühzeitige Diagnose und Differentialdiagnose von T-Zell-Lymphom der Haut. Ein Verfahren zur Diagnose von T-Zell-kutane Lymphome (erythrodermischer Varianten) durch zytologische Analyse des biologischen Materials "Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Material ein Blutabstrich ist fixiert sind, Ribonuklease Behandlung durch, gefärbt mit Gallocyanin-Chromalaun mikrodensitometriruyut Interphase Chromatin-Lymphozyten auf der Grundlage dieser Parameter (OD4 - Absorption Euchromatin; FORM_P - der Formfaktor des Kerns; IOD2 - integrierte optische Dichte von Heterochromatin; Bereich - Kernbereich) berechnet: DF = -0,14379 B OD4 + 0,00003 × IOD2 + 10,4952 B FORM_P + 0,0001 × AREA - 11,1241 und ein negativer Wert dieses Indikators ist T-Zell - Lymphom der Haut diagnostiziert.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, und zwar für den dermatologischen und Hematology, vorgesehen für die frühe Diagnose und Differentialdiagnose von T-Zell - Lymphome der Haut.

Meistens ist es erforderlich, die Erythrodermie Varianten von T-Zell-Lymphome und Erythrodermie Haut, was in gutartigen entzündlichen Dermatosen zu differenzieren (Ekzem, Psoriasis, Neurodermitis und andere.). Darüber hinaus bisher nicht mit erythrodermischer Staaten Veränderungen der Lymphozyten bei Patienten beurteilt, die als predlimfomnye definiert sind: exfoliative Dermatitis Wilson, Brock und rot chromophytosis Algebra. In der klinischen Praxis oft notwendig, die Frage der malignen Transformation in Lymphom chronisch entzündlichen Dermatosen zu lösen.

Bestehende Verfahren zur Diagnose von T-Zell-kutane Lymphome können nicht in vollem Umfang die Ärzte erfüllen, da sie ermöglichen, die Diagnose nur dann, wenn die Symptome sind schwere, zeitaufwendig in der Ausführung (immunologische, cytochemischer, zytogenetischen und andere.) Und spiegeln nicht Veränderungen der Population von Lymphozyten, die Bösartigkeit charakterisieren Prozess.

Eines der bekannten Diagnoseverfahren ist die Detektion von atypischen Lymphozyten bei Patienten mit Erythrodermie in malignen T-Zell-Lymphome. Dazu gehören erythroderma erythrodermischer Form der Mycosis fungoides und Sézary-Syndrom, das nun als leukämische Variante der Mycosis fungoides eritrodermicheskoy Form angesehen wird.

Frühere Versuche abnormale T-Lymphozyten (Sezary-Zellen) in Patienten mit Erythrodermie zu beschreiben. Jedoch jedes der folgenden Verfahren hat seine Nachteile.

Histologie eritrodermicheskoy Zustände spiegeln nicht immer den Prozess der nosologischen Spezifität, aufgrund einer starken entzündlichen Komponente von Biopsiematerial. Oft wird die Diagnose für mehrere Biopsien erforderlich, die für den Patienten traumatisch.

Lichtmikroskopie können atypische Lymphozyten im peripheren Blut detektieren nur in den fortgeschrittenen Stadien der Krankheit, zusätzlich, da die Analyse durchgeführt wird, visuell, das Ergebnis ist eine qualitative Beschreibung der Morphologie, die nicht zu quantifizieren erlaubt und Objektivierung der Ergebnisse [1].

Elektronenmikroskopische Studien liefern eine allgemeine Vorstellung von der Verteilung des Chromatins in Lymphozyten, aber das Verfahren ist nicht der funktionelle Status des Genoms zu bewerten, eher mühsam, insbesondere bei der Herstellung des Materials für die Studie [2],

Rasterelektronenmikroskopie kann in der Diagnose eritrodermy als nicht möglich verwendet werden, Informationen über Änderungen in den Kernen von Lymphozyten, die für die Diagnose von [3] zu erhalten.

Zytochemische Studien keinen klaren Unterschied im Gehalt an Enzymen in reaktiven T-Lymphozyten in gutartigen entzündlichen Dermatosen und bösartige T-Lymphom bieten, das heißt Keine spezifischen cytochemischen Marker Sezary-Zellen [4].

Zytophotometrie spiegelt ihre Lymphozyten-Proliferationsaktivität basierend auf einer Bestimmung von Zellen Thymidin nur bei S-Phase enthält, und nicht Umverteilung Chromatin Qualität in jeder Zelle widerspiegeln [5].

Zytogenetische Untersuchungen haben strenge Spezifität und nicht immer zeigen die pathologischen Veränderungen auch bei weit fortgeschrittenen Prozesse [6].

Morphometrie von Lymphozyten zeigt, dass der Grad der Unregelmäßigkeit des Kerns durch das Verhältnis des Umfangs des Kerns bestimmt ist die Kernkontur Index, der die größte in Sezary-Zellen und den niedrigsten in Lymphozyten von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie war. Aber die Verwendung von nur der Methode der klassischen Morphometrie ist unmöglich, die Feinstruktur des supramolekulare Organisation von Chromatin im Zellkern zu bewerten [7].

Die Immuno-phänotypische Charakterisierung monoklonaler Antikörper unter Verwendung von spezifischen Tumormarker auf den Membranen von Lymphozyten zu identifizieren, ist die informativsten für die Diagnose von Manifestationen von T-Zell-Lymphome und Differentialdiagnose von benignen entzündlichen Hauterkrankungen. Jedoch erfordert dieses Verfahren eine teure Reagenz, um T-Zell-Lymphome in den späteren Stadien der Erkrankung zu diagnostizieren, wenn Lymphadenopathie Infiltration und Haut exprimiert als das Verfahren in dieser Anmeldung vorgeschlagen, und es gab Schwierigkeiten bei der Materialvorbereitung für die Studie wegen Blut wird aus einer Vene gezogen, die für den Patienten mit Hautverletzungen traumatischer ist, [8].

Dieses Verfahren kann als Prototyp angesehen werden, weil es die informativsten für die Diagnose von T-Zell-Lymphome und Differentialdiagnose von benignen entzündlichen Hauterkrankungen ist.

Formulierung der Reaktion wird in drei Stufen durchgeführt.

I. Isolierung und Herstellung für die Herstellung von Lymphozyten-Reaktion.

Blutentnahme aus der Cubitalvene und Selektion von Lymphozyten durch das herkömmliche Verfahren in der Dichtegradientenzentrifugation FECO-verografin. Die Zellzahlen in Goryaeva Kammer durchgeführt.

II. Vorbereitung und die Reaktion der indirekten Immun leiten.

Auf sauberen entfettete Glas beschichteten Vertiefungen von Parafilm, 4 pro Fall. In jede Vertiefung der angewandten Poly-L-Lysin, die Zellen zu fixieren. Der Wirkstoff wird für 40 Minuten bei 37 o C. Die Formulierung in den Inkubator inkubiert der Reaktion von aufeinanderfolgenden Inkubationen besteht. Erste - eine Zellsuspension, dann gewaschen und Medikamente werden monoklonale Antikörper in die Vertiefungen aufgetragen. Nach dem Waschen der Antikörper-Präparationen wurden mit Antiserum gegen Maus-Ig-G, Behandlung von Fluoresceinisothiocyanat inkubiert zu entfernen. Dann wurden nach Waschen mit Kochsalzlösung Mittel Glycerin gemischt gegossen (1: 1) und mit einem Deckglas bedeckt.

III. Zählen von Subpopulationen von T-Lymphozyten in dem Fluoreszenzmikroskop mit Phasenkontrast-Vorrichtung ausgestattet.

Bestimmen das Verhältnis der Zellen, die eine ringförmige Beleuchtung aufweist, wobei die Gesamtzahl der in der Phasenkontrasteinrichtung gezählten Zellen, ausgedrückt als Prozentsatz, der den Gehalt an bestimmten phänotypischen Populationen reflektiert und kann auf dem Testmaterial auf eine spezifische nosologischen Form (T-limfoproliferiruyuschy Prozess) zugeschrieben werden. Diffus-gefärbte (tote) Zellen werden nicht gezählt.

Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein Verfahren zur Früherkennung und Differentialdiagnose von T-Zell-Lymphome zu liefern, Haut (erythrodermischer Varianten) und Verletzungen des Patienten zu reduzieren.

Das Verfahren ist wie folgt :

Vorbereiten eines peripheren Abstrich von Blut aus dem Finger entnommen, fixiert (z.B. Nikiforov Mischung aus Ethanol und Ether im Verhältnis 1: 1) für 15 bis 20 min, in der Luft getrocknet. Die Verarbeitung erfolgt Ribonuklease, Ribonuklease (Reanal, BHP) in einer Konzentration von 200 ME / 100ml in osmolare Saccharoselösung verdünnt. Die Behandlung dauert 50 - 60 Für Minuten bei einer Temperatur von 37 ° C, wonach ein Abstrich in 3 Änderungen destilliertem Wasser gewaschen wird. Die Farbbildungslösung , Gallocyanin-Chromalaun (MCC), nach dem Standardverfahren hergestellt [9] 3 - 5 Minuten, die abgesetzte Leitungswasser - 4 Stunden bei 37 ° C. Das Produkt wird mit 4 gewaschen.

Nach der Färbung Formulierung und mit einem Deckglas abgedeckt mikrodensitometricheskoe Forschung auf Bildanalysesystem durchgeführt. microdensitometers führen ist optisch, topologischen und geometrischen Eigenschaften des Zwischenphasen Chromatin Komponente (Euchromatin und Heterochromatin) und dem Kern als Ganzes.

Bisher bei Trainingsproben wurden für diese informative Indikatoren für Pathologie Struktur der Interphase Chromatin etabliert:

OD4 - Absorption Euchromatin;

FORM_P - der Formfaktor des Kerns;

IOD2 - integrierte optische Dichte von Heterochromatin;

AREA - Kernbereich.

Für eine umfassende Beurteilung dieser Indikatoren berechnet Parameter: DF = -0,14379 B OD4 + 0,00003 × W IOD2 + 10,4952 FORM_P + 0,0001 × AREA - 11,1241.

Die Formel für die DF-Parameter Berechnung erhaltenen linearen Diskriminanzanalyse mit [10] durch eine Standard-Statistik-Software-Paket. Ein negativer Wert des Indikators diagnostiziert DF mit T-Zell-Lymphom der Haut.

Eine ähnliche Verbindung zwischen den numerischen Werten hergestellt, wenn Gruppen von Patienten untersucht wird in der Klinik von Haut MONICA über T-Zell-Lymphom der Haut (11 Personen) und gutartigen entzündlichen Dermatosen (- 10 Personen Psoriasis und atopische Dermatitis) behandelt. Die Analyse zeigte die wichtigsten Indikatoren der Struktur des Zwischenphasen Chromatin peripheren Blutlymphocyten, berechnet der abgeleitete Parameter DF T-Zell-Lymphom der Haut zu identifizieren.

Beispiel 1. Patient B ,, 63 Jahre, Geschichte N - 7646, Monica.

Er trat in die Klinik mit Beschwerden von Rötung, Juckreiz, Brennen, Schüttelfrost.

Klinische Diagnose: T-Zell-Lymphom der Haut, erythrodermischer Bühne.

Während der Behandlung in der Klinik in dieser Anwendung angeboten bedeutet das Chromatin von Interphasekernen von Lymphozyten von Patienten peripheren Blut wurde untersucht, und die Standard-Methode verwendet, indem Sie einen Abstrich von Vollblut von einem Finger genommen vorbereitet. Die resultierende Abstrich Luft getrocknet, mit Nikiforov fixiert. Ferner wurde die Wirkung von Ribonukleinsäure Scan-Ergebnisse Ribonuklease Behandlung eliminiert durchgeführt. Ribonuclease verdünnt osmolar Saccharoselösung in einer Konzentration von 2000 E pro 100 ml Lösung. Zubereitungen in dieser Lösung behandelt , für 1 Stunde bei 37 o C, wonach sie in 3 Austauschen von destilliertem Wasser gewaschen wurden. Ferner sind die Färbemittel in MCC-Lösung. MCC-Lösung wird durch das Standardverfahren hergestellt [9]. Färbung wird bei 37 o C für 3 Stunden in einem Thermostat durchgeführt, wonach die Vorbereitungen für 5 Minuten mit Leitungswasser Überstand gewaschen.

Medikamente häufig in Kanadabalsam eingebettet und untersucht nach dem Trocknen auf Bildanalysesystem.

Chromatinstruktur Indikatoren, um den Patienten zu untersuchen:

OD4 - 3,02207; FORM_P - 0,82145; IOD2 - 39080,8; AREA - 7938,7.

Weitere integrierte Beurteilung Indikator DF = -0,9710674 berechnet wurde,

Der Wert des DF <0; Daher ergab sich der Patient Veränderungen in der Struktur des Zwischenphasen Chromatin geeigneten T-Zell-Lymphom der Haut, die vollständig mit den Daten von klinischen und Laborforschung zusammenfällt.

Beispiel 2. Patient B., 40 Jahre alt, N-Historien 14762, Monica.

Er trat in die Hautklinik Monica von Rötungen beschweren, mehr auf den unteren Extremitäten, Juckreiz.

Klinische Diagnose: Atopische.

Mit dem vorgeschlagenen Verfahren die Chromatinstruktur von Lymphozyten aus dem peripheren Blut des Patienten untersucht wird (vgl. Beispiel 1).

Chromatinstruktur Indikatoren, um den Patienten zu untersuchen:

OD4 - 4,48286; FORM_P - 0,938331; IOD2 - 74411,4; AREA - 13686.

Ferner wurde integriert Beurteilung Indikator DF berechnet = 1,6802235.

Der Wert des DF> 0 entspricht daher identifiziert Chromatinstruktur Veränderungen auf Veränderungen in gutartigen entzündlichen Dermatosen.

Beispiel 3. Patient G., 56 Jahre, N Geschichte - 1497; MONICA.

Er trat in die Klinik mit Beschwerden von Rötung der Haut, Fieber.

Die klinische Diagnose von Psoriasis.

Mit dem vorgeschlagenen Verfahren die Chromatinstruktur von Lymphozyten aus dem peripheren Blut des Patienten untersucht wird (vgl. Beispiel 1).

Chromatinstruktur Indikatoren, um den Patienten zu untersuchen:

OD4 - 3,26156; FORM_P - 0,933456; IOD2 - 79238,4; AREA - 14092,6.

Ferner wurde integriert Beurteilung Indikator DF berechnet = 1,9901397.

Der Wert des DF> 0 entspricht daher identifiziert Chromatinstruktur Veränderungen auf Veränderungen in gutartigen entzündlichen Dermatosen.

Beispiel 4. Patient D., 48 Jahre, N Geschichten - 16105, Monica.

Zugelassen zum Krankenhaus mit Beschwerden von Veränderungen der Hautfarbe (Rötung), Juckreiz, Schüttelfrost, Brennen, Kribbeln. Krank seit der Kindheit, sagte er saisonale Schübe in jedem Frühjahr und Herbst, in den letzten 3 Jahren ohne Vergebung. Zuvor mit Antihistaminika über Neurodermitis behandelt.

Die klinische Diagnose zum Zeitpunkt der Zulassung: T-Zell-Lymphom der Haut.

Klinische Daten über die Zulassung: Haut stagnierenden-bläuliche Farbe, 100% erythroderma, schwere Infiltration, vergrößerte periphere Lymphknoten alle Gruppen, vor allem die Oberschenkel- und Leisten (bis zu 4 - 5 cm).

Mit dem vorgeschlagenen Verfahren die Chromatinstruktur der peripheren Blut-Lymphozyten Patienten untersucht (siehe. Beispiel 1).

Chromatinstruktur Indikatoren, um den Patienten zu untersuchen:

OD4 - 4,78724; FORM_P - 0,944441; IOD2 - 66646,9; AREA - 11071,9.

Ferner wurde integriert Beurteilung Indikator DF berechnet = 1,206237183.

Der Wert des DF> 0 entspricht daher identifiziert Chromatinstruktur Veränderungen auf Veränderungen in gutartigen entzündlichen Dermatosen.

Die Untersuchung in der Klinik im peripheren Blut schmiert, fand der Patient Sézary einzelne Zellen (Blasten, ähnlich groß Variante), aber am Ende der Studie Biopsie - Neurodermitis (typisch).

Die Behandlung tavegilom, Aktivkohle, gemodez, kleritinom der Patient Verbesserung der Gesundheit festgestellt, Reduktion von Erythema und Hautinfiltration.

So haben unsere klinischen Untersuchung von Patienten und Wirksamkeit der Therapie die Anwesenheit von Patienten mit gutartigen entzündlichen Dermatosen (Neurodermitis) bestätigt.

Beispiel 5. Patient P., 80 Jahre, Geschichte N - 9743, Monica.

Zugelassen zum Krankenhaus mit Beschwerden von Juckreiz, Rötung, Fieber, Kribbeln, Brennen. Krank seit 1970, die zuvor mit Prednisolon über Neurodermitis behandelt.

Während den 4 Monaten vor der vorliegenden Aufnahme in das Krankenhaus Patienten wurden in einer Hautklinik MONICA mit Verdacht auf exfoliative Dermatitis-Brock Wilson untersucht.

Das Ergebnis der histologischen Untersuchung von Hautbiopsie: ändert konsequenter generalisierter Erythrodermie.

Die klinische Diagnose zum Zeitpunkt der Zulassung: allergische Dermatitis.

Klinische Daten über die Aufnahme: Die Haut ist leuchtend rot; ausgeprägte Infiltration, 100% erythroderma, schütterem Haar, markiert Lichtschwiele auf den Handflächen und Fußsohlen, mäßig vergrößert Achselhöhlen, Leisten und Oberschenkel Lymphknoten.

Mit dem vorgeschlagenen Verfahren die Chromatinstruktur der peripheren Blut-Lymphozyten Patienten untersucht (siehe. Beispiel 1).

Chromatinstruktur Indikatoren, um den Patienten zu untersuchen:

OD4 - 4,10798; FORM_P - 0,820714; IOD2 - 42548,7; AREA - 8391,45.

Weitere integrierte Beurteilung Indikator DF = -0,9856234 wurde berechnet.

Der Wert des DF <0; Daher identifiziert Veränderungen entsprechen Veränderungen in der Chromatinstruktur mit T-Zell-Lymphom der Haut.

Die Untersuchung ergab, Änderungen in der Klinik im peripheren Blut (Lymphozyten - 72%, Sézary-Zellen - 15%); Biopsie bestätigte die Diagnose von T-Zell-Lymphom: Sezary cindrom, diffuse Infiltration mit Polymorphismus Mikroabszesse in großen Mehrzellen einzuschleusen.

Die Übereinstimmung der Ergebnisse von Tests des vorgeschlagenen Verfahrens durchgeführt, unter Verwendung von und das klinische Bild schlägt ein Verfahren zur Diagnose Spezifität T-Zell-Lymphome, Haut (Erythrodermie Varianten).

So wird im Vergleich mit dem Prototyp, wobei das Verfahren der frühen Diagnose und Differentialdiagnose von T-Zell-Lymphome, Haut ermöglicht:

a) Identifizierung der malignen Form von Lymphozyten in den früheren Stadien, wenn es Sezary-Zellen nicht erkannt wird und eine Diagnose vor der Entwicklung der klinischen Manifestationen schaffen;

b) eine Differentialdiagnose eritrodermicheskoy Zustände mit T-Zell-Lymphom der Haut und gutartigen entzündlichen Dermatosen;

c) das Trauma Patienten mit einer Hautkrankheit zu reduzieren, wie Blut für die Forschung aus einer Vene nicht genommen wird, und von dem Finger.

LITERATUR

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10. A. Afifi, S. Eisen Statistische Analyse: ein Ansatz mit einem Computer. Trans. aus dem Englischen. - M:. Mir, 1982. - 488 p.

FORDERUNGEN

Ein Verfahren zur Diagnose von T-Zell-kutanen Lymphomen (Erythrodermie Varianten) durch zytologische Analyse von einem Patienten, von dem biologischen Material aufgenommen ist, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Material genommen Blutausstrich fixiert sind, durch Behandlung Ribonuklease, gefärbt mit Gallocyanin Chromalaun mikrodensitometriruyut Zwischenphasen Chromatin-Lymphozyten auf der Grundlage dieser Parameter (OD 4) die optische Dichte von Euchromatin, Faktor FORM_ P Form des Kerns; IOD 2 optische Dichte von Heterochromatin integriert; AREA Kernbereich), berechnet die DF -,14379 OD × 4 + 0,00003 × 1OD 2 + 10,4952 W FORM_P + 0.001 W AREP 11,1241 und einem negativen Wert dieses Indikators wird diagnostiziert , T-Zell - Lymphom der Haut.

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Erscheinungsdatum 01.04.2007gg