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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2205410

Verfahren zur Herstellung von anti-idiotypischen Serum für die Diagnose von bösartigen Tumoren

Verfahren zur Herstellung von anti-idiotypischen Serum für die Diagnose von bösartigen Tumoren

Name des Erfinders: Panteleev Dmitry Y .; Shein Yuriy Germanovich
Der Name des Patentinhabers: Panteleev Dmitry Y .; Shein Yuriy Germanovich
Korrespondenzanschrift: 121609, Moskau, Herbst Boulevard, 11, (609 Post), Unternehmen "VIS", pat.pov. NA Triposhinoy, Kenn-Nr 472
Startdatum des Patents: 2000.05.19

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, und zwar auf der Immunologie und kann zur Diagnose von malignen Erkrankungen verwendet werden. Das Verfahren besteht darin, dass in einem syngenen System, wobei die erste Stufe erheblich an ein Tier syngenen fetalen Chorion Gewebezellen auf 12,7-Tage-Maus entsprechenden embryonalen Gewebe von schwangeren weiblichen Tieres der gleichen syngenen System erhalten Verabreichung produzieren, in einem zweiten Schritt durch nach 5-14 Tagen nach der Entnahme embryonaler Zellen aus einem immunisierten Tier Leukozyten eintritt und sie in den Körper eines Tieres syngen mit der vorherigen Einführung und nach 4-12 Tagen nach der letzten Immunisierung, Serum durch Abtasten Blut des Tieres wurde hergestellt, die bei Raumtemperatur belassen, ist ein dichter zu bilden Gerinnsel, und dann für die komplette Blutsenkungsgeschwindigkeit zentrifugiert; resultierende Serum gesammelt, erhitzt auf 60 ° C , um überschüssiges Homogenat syngenen tierischen Zellen, gefolgt von Zentrifugation und Filtration adsorbieren. An beiden Stufen können Eingangs antimitotische Mittel von Zellen, verarbeiten, oder sie Immunstimulantien oder Ersatz der gesamten Membranfraktion von Zellen einzuführen. Das technische Ergebnis ist die Effizienz und die Zuverlässigkeit der Diagnose von malignen Tumorerkrankungen zu erhöhen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, insbesondere auf Immunologie und betrifft ein Verfahren zur Herstellung von anti-Idiotyp - Serum antiembrionalnoy als Mittel verwendet , um für die Diagnose von Krebs eines Patienten zu testen.

Nach vorläufigen Hypothese in dem Prozess des Tumorwachstums und der Embryonalentwicklung gibt (Funktionen) ähnlichen Mechanismus der interzellulären (Inter) Umsetzen, in Unterstützung dieser Hypothese die Verwendung eines anti-idiotypischen antiembrionalnoy Serum schlägt, kann die Wirkung, die zum Nachweis des Tumorwachstums und / oder Tumorwachstum wesentlich sein. Ähnliche Serum verwendet, um eine universelle Methode zur Diagnose von malignen Tumoren zu erzeugen (siehe. UdSSR Nr 1.836.640, G 01 N 33/80, publ. 08.23.93).

Bekannte Verfahren Krebs zu diagnostizieren durch Sedimentationsgeschwindigkeit unter der Wirkung der beiden Mittel zu untersuchen - antiembrionalnoy anti-Idiotyp-Seren und Kontrollseren zur gleichen Zeit wie das erste Mittel ein Rattenserum, und die zweite - das Serum von Ratten, die syngenen Tiere zuvor eingeführten Lymphozyten hatten (RF-Patent 2.111.495 zu sehen. , G 01 N 33/80, publ. 05.20.98). Und die Diagnose ist die minimale und die maximale Steigung Sedimentationsrate der roten Blutzellen in den Patienten-Seren Daten und Berechnung nach Formel Koeffizienten malignes Wachstum zu finden, dessen Wert weist auf das Vorhandensein / Fehlen eines bösartigen Tumors.

In diesem Verfahren antiembrionalnaya idiotypischen Serum als Mittel verwendet zur Änderung der Sedimentationsgeschwindigkeit der roten Blutzellen des Patienten im Vergleich zur Kontrollserum in dem Fall des Vorhandenseins von malignen Tumorzellwachstum.

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit der Aufgabe, ein Anti-Idiotyp-Serum antiembrionalnoy Eigenschaften zu schaffen, die visuell zu überwachen, das Vorhandensein maligner Tumorzellwachstum, unabhängig von der Histogenese, nachweisbar in der Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen würde. Die erzielbare technische Ergebnis wird die Effizienz und die Zuverlässigkeit der Diagnose von malignen Tumorerkrankungen zu erhöhen.

Dieses technische Ergebnis wird dadurch erreicht, dass die Herstellung eines Anti-Idiotyp-antiembrionalnoy Serum syngenen System in der ersten Phase erzeugen Verabreichen von schwangeren Frauen erhalten zuverlässig syngenen Tier 7-12 Tage alten embryonalen Zellen dem Chorion Gewebe in der zweiten Stufe nach 5-14 Tagen nachdem die embryonale Zellen aus tierischen Leukozyten imunnogo genommen Eingabe und führen sie in einen anderen Organismus, frühere syngenen Tier, und nach 4-12 Tage nach der letzten Immunisierung, die Bildung einer ausreichenden Menge imunnogo Komponente im Blutserum des Tieres wird durch Abtasten seines Blutes erhalten, die noch übrig ist bei Raumtemperatur ein dichtes Gerinnsel zu bilden, und dann für die komplette Erythrozytsedimentbildungrate zentrifugiert; resultierende Serum gesammelt, erhitzt auf 60 ° C , um überschüssiges Homogenat syngenen tierischen Zellen, gefolgt von Zentrifugation und Filtration adsorbieren.

An beiden Stufen können Eingangs antimitotische Mittel von Zellen, verarbeiten, oder sie Immunstimulantien oder Ersatz der gesamten Membranfraktion von Zellen einzuführen.

Mit "ausreichend" Anzahl der Immunkomponente bedeutet, dass die Konzentration von Immunglobulinen (Klasse G und M) im Blut des Tieres, die weiter unten beschrieben Diagnosetechniken auszuführen erlauben würde. "Ausreichend" (oder die Konzentration von Immunglobulinen der Klasse G und / oder M) kann durch andere bekannte Verfahren bewertet werden, zum Beispiel:

a) die Reaktion von Lymphozyten Blastentransformation, oder

b) die Reaktion von Niederschlag, oder

c) Enzym-Immunoassay, oder

d) Radioimmunoassay usw.

Das vorgeschlagene Verfahren setzt voraus, dass das Endprodukt, das in der letzten Stufe genommen Immunserum von einem immunen Tier. Beispielsweise im Fall von zweistufigen Immunisierung Blutentnahme von der immune Tier 2 in dem Fall von 3-Schritt der Immunisierung des Tieres 3, durchgeführt usw.

Immunkomponente kann in der letzten Stufe erhalten:

a) Immunzellen, die Immunglobuline der Klasse G und / oder F erzeugen, oder

b) monoklonale Antikörper, die basieren auf der Lymphozyten oder

c) die tatsächliche Immunglobulinen G und / oder F, oder

d) Fab-Fragmente von Immunglobulinen (C), oder

e) insgesamt Serum als die einfachste Option.

Diese Eigenschaften sind wichtig und miteinander eine stabile Kombination von wesentlichen Merkmalen zu bilden, das Serum ausreichend zu erhalten, mit den folgenden Eigenschaften:

- Gemischt mit roten Blutzellen von Patienten mit bösartigen Tumoren der Agglutination von roten Blutkörperchen in einem ziemlich großen Prozentsatz der Fälle;

- Die Methode der indirekten Immunfluoreszenz ergab spezifische Membran (peripherer) Glühen von bösartigen Tumorzellen, unabhängig von der Histogenese mit Fluoreszenzmikroskopie, die universelle Tropismus (Suszeptibilität) das resultierende Serum auf Tumorzellen demonstriert und kann zur Erstellung von pathologischem Testsysteme als Grundlage dienen.

Das Wesentliche eines Verfahrens für das Mittel zu erzeugen. In syngenen System streng ein mehrstufiges Immunisierung durchgeführt. Im einfachsten Fall ist es möglich, im wesentlichen zwei Schritte zu begrenzen. Die erste von ihnen ist in der Einführung des Organismus erheblich syngenen tierischen Zellen abgeleitet von schwangeren Frauen in einem bestimmten Stadium der Schwangerschaft gemacht. Eingangszellen als Zellen der Embryo richtigen und Chorion Zellen enthält. Nach der erforderlichen Zeit werden die Tier imunnogo Leukozyten durch irgendwelche Mittel gesammelt und in den Körper eines anderen eingeführt wird, mit dem vorherigen syngenen Tier. In beiden Phasen verabreicht werden Verarbeitungszellen antimitotische Mittel, mit der Einführung von Immunstimulantien (Adjuvantien) oder ohne Substitution oder der Membranfraktion von ganzen Zellen. Serum (oder Immunkomponente) von der letzten Gruppe von Tieren, die nach der Zeit, um eine ausreichende Menge imunnogo Komponente im Blut des Tieres erforderlich zu bilden nach der zweiten Stufe der Immunisierung.

Jedes System kann syngenen Tieren verwendet werden, vorzugsweise Mäuse verwendet.

Idiotypischen Serum wurde wie folgt hergestellt.

1. Herstellung von 12 Tage alten embryonalen Maus - Zelllinie BALB (c) und die erste Immunisierung zu halten.

Am Tag 12 trächtige Weibchen geschlachtet Traktion der Halswirbelsäule oder anderen zur Verfügung stehenden Mitteln. Vordere Bauchwand wurde mit 95% Ethanol behandelt, wird über die Vorderfläche geöffnet. Die beiden Hörnern der Gebärmutter von den Verbindungsgefäße getrennt (Mesenterium wird geschnitten), geschnitten vaginal Abteilung ihre Gebärmutter und zu einem Überschuß einer kalten Lösung Version übertragen. Der Uterus wurde geschnitten, um dlinniku, getrennt Backen in embryonalem Gewebe mit einer Lösung Chorion-Gewebe. Überschüssige Lösung wird Version Pasteur-Pipette entfernt, die Reste der Königinnen zu entfernen. Embryonale Gewebe Chorion fein gemahlen mit einer Schere und viel frische kühle Version der Lösung wird für 25 bis 30 Minuten auf einem Magnetrührer in sterilen Ampullen überführt. Nach der angegebenen Zeit wurde die Aufschlämmung durch ein Doppelschicht-Filter Gaze filtriert, wurden die Zellen dreimal mit überschüssigem kaltem Hanks-Lösung (bei 1500 U / min 3-4 min) gewaschen. Die Konzentration der lebenden in der Lösung gezählten Zellen in der Kammer Gorjacheva in bekannter Weise. Pre-Zellen durch Zentrifugation bei 1500 U / min pelletiert, entfernen Sie überschüssige Hanks Lösung, und das Zellpellet GAF zu machen (GAF - Freud unvollständigem Adjuvans) in Höhe von 10 Millionen Zellen -. 0,1 ml IFA. Das Gemisch wurde resuspendiert, um eine stabile Emulsion zu bilden, und verabreicht tropfenweise zu der Rückseite von syngenen Tieren Rate von 0,1 ml pro Emulsion.

2. Durchführung der zweiten Immunisierung aus.

14 Tage nach Beendigung der ersten Stufe der immune Tiere getötet, und die Vorbehandlung erfolgt analog der oben Schnitt durchgeführt. Die Milz wird entfernt und übertragen sie in einem Mixer mit 4 ml Lösung Version. Das Homogenat wurde durch ein Doppelschicht-Gazefilter filtriert, das Gemisch einmal in Hanks-Lösung gewaschen, und die Mischung wurde auf Ficoll geschichtet-verografin (Dichte - 1077). Isolierung der Milzzellen (d.h. Leukozyten aus der Milz hergestellt) bei 2000 den Dichtegradienten Herstellung U / min für 20-25 min (je nach dem ursprünglichen Volumen der Aufschlämmung), und weiter, bis eine deutlich erkennbare "Ring" an der Grenze der Lösungen liegt . Die Splenozyten ( "Ring") sind fein Pasterka, einmal in Hanks-Lösung gewaschen gezogen ausgewählt haben, wird eine Suspension bestrahlt. Die Strahlendosis betrug 50 Gy (dh 5.000 rads). Herstellung von Zellzahl und zu drei der gewaschenen Zellen nach der Bestrahlung unvollständig Freud-Adjuvans, gleichen Basis wie in Anspruch 1. Die Emulsion wurde intraperitoneal in syngene Tiere aus einer Geschwindigkeit von 0,1 ml pro verabreicht.

3. Herstellung von Serum

12 Tage nach der letzten Immunisierung Blut wird vom Herzen unter Etheranästhesie Kavitäten entnommen. Das erhaltene Blut wurde bei Raumtemperatur stehen ein dichtes Gerinnsel zu bilden, zentrifugiert bei 1500 U / min, 2-3 Minuten für eine vollständige Erythrozytsedimentbildungrate. Serum wurde gesammelt Pasterka fein gezogen, geheizte bei 56 o C für 15 Minuten, überschüssige Homogenat von Leberzellen zu adsorbieren, Niere, Milz von syngenen Mäusen BALB (s), zentrifugiert bei 8-9000 U / min für 20 Minuten, filtriert Millipore - Filter (0,22 Mikron ).

4. Testserum. Die sich ergebende Serum wird auf diese Weise in das Verfahren der indirekten Immunofluoreszenz auf unfixierten Kryostat-Schnitte (6-10 Mikron) jeder Stamm des Tumors (B-16, CC-2 und so weiter.) Überprüft. Serum wird als aktiv betrachtet, wenn die spezifische Membran Lumineszenz Tumorzellen in einer Endverdünnung von 1 detektiert: 1 beträgt.

Im speziellen Fall des Verfahrens der Behandlung möglich antimitotische Mittel an Zellen verabreicht, wie folgt:

a) embryonale Zellen (einschließlich Zellen aus Chorion) linearen Versuchstier (z.B. Maus) nehmen an einem bestimmten Schwangerschaftsalter bedingt Schwangerschaft die Entwicklung des Embryos und die Eigenschaften eines bestimmten Typs von Labortieren.

b) Die unter Punkt angegebenen Zellen. (a), werden durch bekannte antimitotische Mittel verarbeitet (zum Beispiel Mitomycin C, gamma-Strahlung oder andere).

c) Parameter und Zellverarbeitungszeit in n. (b) genug bestimmt ihre Zellteilungsaktivität zu erreichen stoppen und / oder den Stoffwechsel.

d) behandelt, durch n. (c) Zellen in den Körper mit diesen syngenen Labortierzellen zu bekannten Immunstimulantien injiziert werden, werden in immunologischen Techniken verwendet werden (beispielsweise komplettem Freundschem Adjuvans, inkomplettem Freundschem Adjuvans, etc.). Der Verabreichungsweg wird von den Parametern des gekochten Produkts bestimmt.

e) Die Höhe der Immunopotentiator wird durch die Anzahl der Zellen und eine Art Versuchstier ermittelt und die optimale jeweils berücksichtigt, wenn seine Verwendung die Konzentration von Immunglobulin erhöht im Blut eines Immun Tier für eine kürzere Zeit als ohne die Anwendung oder bietet eine größere ihre Konzentration über die gleichzeitig, ohne ihre Verwendung.

f) von behandelten Tieren nach den Ansprüchen. (d, e), weiße Blutzellen werden durch ein beliebiges bekanntes Mittel nach einer bestimmten Zeitspanne gesammelt.

g) Die Zeitdauer des Anspruchs. (f) wird als ausreichend angesehen werden, wenn die Konzentration von Immunglobulinen im Blut eines Immun Tier optimalen Werte erreicht. Die optimale Konzentration von Immunglobulinen in Betracht gezogen werden, wenn die Rate der Erhöhung des Blut eines immune Tier zu sinken beginnt.

h) Leukozyten aus Nos erhalten. (f, g), in ähnlicher Weise verarbeitet antimitotische Mittel Nr. (b, c).

i) Nach der Behandlung von Leukozyten nach Anspruch. (h) zu erzeugen, deren Einführung Immunstimulantien (wie in pp.d, e) in dem Körper mit syngenen Tier Leukozyten in einer Menge und Volumen für eine optimale optimale Titer von anti-idiotypischen Antikörpern.

j) Der Titer der anti-idiotypische Antikörper wird als optimal betrachtet, wenn Idiotypen fötalen Stadium-Antigene auf Tumorzellen in den bekannten Testmethoden nachweisen kann.

k) von der Konzentration des anti-idiotypischen Antikörper in einem Labortierblut erreichte nach Anspruch behandelt. (i) gemäß Anspruch ausreichend. (j), zu produzieren Immunselektionskomponente, deren Zusammensetzung oben offenbart.

Verfahren Ausführungsform ist ein Verfahren, gekennzeichnet durch Nos. (D, i), wobei die ganzen Zellen mit einer biologisch aktiven Fraktion ersetzt werden (beispielsweise Membranen oder deren etc.). Ersatz wird als ausreichend, wenn es zu dem Ergebnis führt, für n. J).

biochemischer Detektionsverfahren immunologische Malignitäten Zellantigene in das Blut des Patienten auf der Grundlage der Fähigkeit, Erythrozyten mit diesem Serum in Wechselwirkung zu agglutinieren - Antiembrionalnaya idiotypischen Serum wurde mit der Test Umsetzung PO (TURTEST) getestet. Intensität der Reaktion durch eine Änderung in der Blutsenkungsgeschwindigkeit in Wechselwirkung mit Serum anti-idiotypische antiembrionalnoy verglichen mit ihrem Absetzen durch die Wechselwirkung mit dem Kontrollserum quantifiziert. Maligne Zellwachstumsfaktor (K sp) wird wie folgt bestimmt: den Mittelwert von den beiden Steuer erhaltenen Proben und der Probe mit anti-idiotypischen um 50 antiembrionalnoy Serum geteilt durch den Wert multipliziert arbeiten und eine große Menge an 3 - Sonden. Wenn das Ergebnis größer als 1,5 ist, zeigt es das Vorhandensein eines malignen Tumors Prozess im Körper des Patienten.

Die Effizienz dieses Serums bei der Diagnose von bösartigen Tumoren wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Ein Patient mit einem Tumor im linken Vorhof wurde zum Studium an PO-Test unterzogen. Es betrug 2,3 sp. Dies war der Grund für die Annahme des Vorhandenseins von malignen Neoplasmen. Nach der Operation bestätigt Histologie Bösartigkeit - fibromiksosarkomu Atrium links.

Beispiel 2

Der Patient S. bösartiger Tumor des Perikards (malignes Mesotheliom) wurde nach einer Biopsie entdeckt. Nach PO Test maligne sp Wachstumsfaktor K betrug 2,8, die die anfängliche Diagnose von Krebs bestätigt.

Beispiel 3

Vier Patienten mit Vorhofmyxom Rechts-RO-Test wurde vor der Operation durchgeführt wird; K sp 0.8. Nach der Operation bestätigt Histologie die gutartigen Tumoren.

Beispiel 4

Drei Kinder mit Rhabdomyom in der rechten Herz-RO-Test wurde vor der Operation durchgeführt. K sp 0,9; 0,96 und 1,1 auf. Im Anschluss an die Operationen Histologie bestätigte die Anwesenheit nemiksomatoznyh gutartige Herztumor - rhabdom.

Die Studie wurde in verschiedenen Krankenhäusern der Russischen Föderation über mehr als 10.000 Patienten durchgeführt. Insbesondere durchgeführten Studien im NC-MHS sie. Bakulev RAMS und NFM 9 das Ministerium für Gesundheit, die folgenden Ergebnisse zeigten (siehe. Tabelle). Die Tabelle zeigt, dass die Empfindlichkeit des Verfahrens sehr hoch, fast 100% erreicht, was die hohe diagnostische Wertigkeit von Serum durch das Verfahren gemäß der Erfindung erhalten bestätigt.

Idiotypischen Serum durch das vorgeschlagene Verfahren erhaltene ist wirksam bei der Diagnose von Tumoren verschiedenen Lokalisierungen und in jedem Stadium der Entwicklung von Krebs.

FORDERUNGEN

entsprechend 12,7-Tage-Maus 1. Verfahren zur Herstellung von Anti-Idiotyp-Seren für bösartige Tumoren Diagnose, umfassend, dass wesentlich in der ersten Phase in der syngenen System erzeugen, um ein Tier syngenen fetaler Zellen aus Chorion Gewebe Verabreichung von schwangeren weiblichen Tieren gewonnen embryonalem Gewebe die gleiche syngenen System, wobei die zweite Phase nach 5-14 Tagen nach embryonalen Zellen aus einem immunisierten Tier Leukozyten und führen sie in den Körper eines Tieres syngenen mit dem vorherigen und nach 4-12 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen Eingabe Serum wurde durch Abtasten Blut des Tieres hergestellt dass bei Raumtemperatur stehen gelassen ein dichtes Gerinnsel zu bilden , und dann zur vollständigen Erythrozyten abgeleitet Serum zentrifugiert gesammelt, erhitzt auf 60 ° C überschüssiges Zellhomogenat von syngenen Tieren durch Zentrifugation und anschließende Filtration zu adsorbieren.

2. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß beide Eingangsstufen Zellen antimitotische Mittel behandelt, oder injiziert sie mit Immunstimulantien oder ganze Membranfraktion von Zellen ersetzen.

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Erscheinungsdatum 02.04.2007gg