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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2208786

METHODE Bestimmung spontane zelluläre Zytotoxizität

METHODE Bestimmung spontane zelluläre Zytotoxizität

Name des Erfinders:. Nischen - ES; Galustyan A.
Der Name des Patentinhabers: Staatliche Bildungs Hochschule St. Petersburg State Pediatric Medical Academy
Korrespondenzanschrift: 194100, St. Petersburg, ul. Litauisch, 2, St. Petersburg State Pediatric Medical Academy, das Patentamt, O.V.Zheleznyakovoy
Startdatum des Patents: 2001.12.28

Die Erfindung betrifft die Medizin und kann in der Immunologie, Virologie, Krebs, Transplantation verwendet werden. Das Verfahren ist wie folgt: von der peripheren mononukleären Blutzellen des Patienten isoliert ist, wird die Zielzelle bereit, die als die Rattenmastzellen verwendet wird, wurden mononukleäre Zellen gemischt und Zielzellen bei einem Verhältnis von 20-30: 1, wurde die resultierende Mischung für 30 Minuten inkubiert, zentrifugiert, nachdem es wird durch Zählen der Anzahl von degranulierten Mastzellen von Ratten als Prozentsatz der Gesamtzahl der Ratten-Mastzellen in einer Mischung von mononuklearen Zellen und Mastzellen von Ratten cytotoxischen Antwort Ergebnisse halten durchgeführt. Wenn der Wert dieses Index ist 25-35% normaler spontaner zelluläre Zytotoxizität bestimmt, einen Wert von weniger als 25% festzustellen, die reduzierte spontane zelluläre Zytotoxizität und einen Wert des Index von mehr als 35% durch eine erhöhte spontane zelluläre Zytotoxizität bestimmt. Das Verfahren verbessert die Genauigkeit der Prognose.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, und zwar auf der Immunologie, Virologie, Krebs, Transplantation, und verwendet werden kann , den Immunstatus von Patienten und gesunden Personen zu bewerten; das Niveau der antivirale und antitumorale Abwehr des Körpers zu bewerten; für Krisen Transplantatabstoßung vorherzusagen.

Bekannte Verfahren der spontanen zelluläre Zytotoxizität Bestimmen (RCC) unter Verwendung als Zielzellen für die zytotoxischen Zellen von Mäusen künstlich kultivierten Tumorzellen, insbesondere Zellen von P815 murine tumor, EL4, BW5147, radiomarkiert. Bekannte Verfahren umfassen Analoge der folgenden Operationen: Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen; Herstellung von Zielzellen, einschließlich Radioisotopen-Markierung von ihnen; Mischen von mononukleären Zellen und Zielzellen, und zeichnet die Ergebnisse der zytotoxischen Reaktion durch den Ausgang des Radionuklids verwendet. Die Verwendung von Radioisotopen wie 31 Cr, 3 [H] prolin, 125 [I] -dezoksiuridin, 3 [H] usw. -uridin [1, 2].

Bekannte Verfahren bieten keine Pendants ein technisches Ergebnis des beanspruchten Verfahrens im Zusammenhang mit der folgenden zu erreichen. Tumor-Zelllinien zur Bestimmung der SCC-Mäuse verwendet werden in der Regel nicht für die Bestimmung von SCC in Menschen verwendet [2]. Gemäß den Erfindern, kann dies auf das Fehlen von spezifischen Rezeptoren auf Zielzellen spezifiziert zurückzuführen sein, wobei die zytotoxische Wirkung von menschlichen Zellen kaum auf die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Zielzellen manifestiert.

Bekannte Verfahren zur Bestimmung SCC Verwendung als Zielzellen für zytotoxische künstlich kultivierten humanen Tumorzellen Maus-Lymphom-YAC-1-Zellen, [3] und myeloische kontinuierlichen Zellinie K-562 [4].

In der Nähe von der beanspruchten Lösung der wesentlichen Merkmale ist die Methode zur Bestimmung SCC Verwendung als Zielzellen myeloide Zelllinie K-562 transplantierten [4]. Das Verfahren für den Prototyp angenommen wurde wie folgt durchgeführt. Das Patientenblut wurde mit 5 ml 0,2% EDTA aus einer Vene in einer Menge von 6 ml Vials gezogen und wurden durch Ficoll-Dichtegradienten / verografin getrennt (d = 1,077). Die resultierende Suspension von mononuklearen Zellen (mononukleare Zellen) wurden einmal in 8 ml Phosphatpuffer gewaschen und zweimal - Hank-Lösung mit 5% Rinderserum. Die Endkonzentration der Zellen wurde auf 5x10 6 / ml RPMI-1640 - Medium mit 10% Rinderserum eingestellt. Herstellung von Zielzellen wurde wie folgt durchgeführt. Die Zelllinie K-562 wurde in Kulturmedium RPMI-1640 gewachsen, die "Zusatzstoffe" angereichert wird: 500 ml RPMI-1640 + 20 mM Glutamin + 20 mM Hepes (Serva) 100 Einheiten / ml Penicillin 10 U / ml Streptomycin oder Gentamicin; eine Serumergänzung verwendet inaktiviertes Rinderserum. Die sterile Phiolen wurden 0,6 ml der Zellsuspension transplantierbaren (enthaltend 3x10 5 Zellen) gegeben, 0,6 ml inaktiviertes Rinderserum und 1,8 ml RPMI-1640 - Medium; Kolben wurden 4 Tage bei 37 o C. Am 4. Tag der Kultivierung, wenn die Zelldichte 5x10 5 in 1 ml Zellen in frisches Medium überimpft erreicht inkubiert. Zellen der 2. oder 3. Tag der Kultur wurden für 5 min bei 150 g abzentrifugiert, in frischem RPMI-1640-Medium mit 10% Rinderserum ergänzt war, resuspendiert. 1x10 6 Zellen wurden mit 250 Mikrometer - Ku 51 Cr (Na 2 CrO 4) , (5 92,5xl0 Bq) mit einer spezifischen Aktivität von 5,2 mCi / mM (7,4-18,5h10 7 Bq) in einem Volumen von 0,5 ml markiert ist ; in einem Inkubator gestellt und für 1 Stunde bei 37 o C. Die Zellen inkubiert wurden dreimal in Hanks Medium mit 5% Rinderserum gewaschen, bei 150 g für 5 min zentrifugiert; Die Endkonzentration der Zellen wurde auf 1x10 5 in 1 ml RPMI-1640 - Medium mit 10% Rinderserum eingestellt. Anschließen der Zielzellen und mononukleären Zellen. In diesem Fall 0,1 ml von Zielzellen (1x10 4 Zellen) wurden in die Vertiefungen einer Rundstab "Cook" fest angesichts der erforderlichen Anzahl von Proben und Umfang der Erfahrung pipettiert. Mononukleären Zellen mit 0,1 ml (0,5h10 6 Zellen) wurden so ausgehoben , dass für jede Probe das Blut für eine Anzahl von Löchern berücksichtigt sucht; sowohl erfahrene als auch Kontrollproben wurden in Triplet getestet; zu Kontrollproben wurde anstelle von 0,1 ml Suspension mononukleärer Zellen 0,1 ml Kulturmedium zugesetzt, entsprach das Verhältnis von Zielzellen und mononukleären Zellen in experimentellen Proben bis 1: 50. In Schritt Pipettieren von 0,1 ml Suspension Zielzelle wurde in Zentrifugenröhrchen gegossen und vor speichernden Ende des Experiments; Sie waren eine maximale Aufnahme von 51 Cr (M) zu bestimmen. Die Platte in einem Inkubator (37 ° C) mit 5% CO Zulauf 2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 100% aufgestellt wurde, die für 16 Stunden. Nach der Inkubation der Vertiefungen mit 0,1 ml des Überstands inkubiert wurde entnommen wurden, Aktivität wurde mit den experimentellen Proben gemessenen Proben zu steuern U -schetchike .

Berücksichtigung der Ergebnisse der Reaktion wurde wie folgt durchgeführt. Die zytotoxische Aktivität von mononukleären Zellen (SCC), ausgedrückt in% bezogen auf die gesamte Aufnahme von 51 Cr und die spontane Freisetzung:



wobei A - das Doppelte des durchschnittlichen Ausgangswert von 51 Cr in den drei Testvertiefungen;

B - ist das gleiche, aber in den Kontrollvertiefungen;

Mit - 80% der gesamten 51 Cr in den Einschlüssen 1x10 4 Zellen (M) -misheney.

Spontane 51 Cr - Ausbeute (V) in einem solchen experimentellen gemittelte 16% der C (1% pro Stunde).

Wenn der Wert dieses Index ist ein Mittelwert von (53,6 ± 3,7)% (der Grad der zytotoxischen Aktivität in gesunden Menschen), gemessen senkrecht zytotoxische Aktivität (SCC). Für Werte dieses Index signifikant mit der Norm verglichen reduziert wurde, bestimmt reduzierten zytotoxische Aktivität (SCC). Für Werte dieses Index deutlich höher als die Durchschnittswerte der zytotoxischen Aktivität bei gesunden Menschen war, bestimmt die erhöhte zytotoxische Aktivität (SCC).

Prototype-Methode [4] erlaubt es nicht, ein technisches Ergebnis erreicht zu erhalten, wenn die erfindungsgemässe Verfahren aus den folgenden Gründen verwenden. Es ist bekannt, dass die Zellen eines lebenden Organismus RCC (im folgenden "zytotoxische mononukleäre Zellen" oder "Effektorzelle" bezeichnet), gehören hauptsächlich zur normalen Mittel und haben die Fähigkeit, fremde Zellen zu zerstören, durch Virus befallenen Zellen, aber auch Tumorzellen .

Derzeit wegen Unfähigkeit erzeugt zytotoxische Reaktionen in vivo-Bestimmung von SCC zur Beurteilung von Laborreaktionen Einstellung Zielzellen unter Verwendung von nicht normalerweise im Körper enthalten ist [2].

Es ist bekannt, dass, wie in dem Prototyp-Verfahren [4] verwendet künstlich kultivierten Tumorzellen der myeloischen Linie kleine Pellets [5], das Ausgangssignal von den Zellen in der zytotoxischen Reaktion ist nahezu unmöglich, unter Verwendung der Mikroskopie zu betrachten. Es ist auch bekannt, dass aufgrund der zytotoxischen Wirkung von mononukleären Prozesse, die in signifikanten morphologischen Veränderungen in Zielzellen führen, treten über einen langen Zeitraum (Inkubation von 16 Stunden auf 5 - 6 Tage) [2].

Darüber hinaus erzeugt die Zieltumorzellen, die nach Ansicht der Autoren der beanspruchten Lösung, keine speziellen hochempfindlichen Rezeptoren spezifisch für Perforin und Zytokinen durch Effektorzellen. In diesem Zusammenhang ist unter Berücksichtigung der morphologischen Veränderungen von Tumorzellen nur möglich, grundsätzlich durch die toten mononukleären Zellen unter der Wirkung der Zielzellen zu zählen. Jedoch ist die Beschreibung eines solchen Verfahrens für die SCC in einer Überprüfung der wissenschaftlichen und medizinischen Literatur und der Patent Bestimmung haben die Erfinder gefunden. Dies kann aufgrund der Tatsache, dass die praktische Umsetzung einer solchen Vorgehensweise unter Verwendung von Standardlabortechniken und Laborgeräte durch eine relativ hohe Subjektivität gekennzeichnet ist und eine relativ geringe Genauigkeit Bestimmung (aufgrund der Möglichkeit der Massen spontanen Abtöten der Zielzellen während der Langzeit-Inkubation), selbst wenn die jeweiligen spezifischen Farbstoffen zur Identifizierung von toten Zielzellen.

Die Basis des Prototyp-Verfahren [4] wird vorwiegend funktionelle Veränderungen der Tumorzielzellen durch die cytotoxische Wirkung von menschlichen Zellen Bilanzierung setzen. Bewertung der zytotoxischen Wirkung durch Markierung Zielzellen mit radioaktivem Chrom-51 durchgeführt. Es ist bekannt [3, 2], dass die zytotoxische Wirkung in direkten Kontakt nur Effektorzellen und Zielzellen durch Effektorzellen, die Produktion verschiedener Cytokine, und daraus folgenden Freisetzung von Mediatoren mit diesen Perforin. In der Prototyp-Verfahren wird nach dem Kontakt der spontane Sedimentation des Zellgemisches auf den Boden des Teströhrchens durchgeführt, die nach 3-5 Stunden beendet. Nach dem Absetzen des Gemisches und das Auftreten von Kontakt zwischen den Zielzellen und zytotoxischen Zellen und Zellprodukten beginnt die Freisetzung von zytotoxischen Mediatoren und ihre Wirkung und auf Zielzellen, die von 12 bis 140 Stunden dauert. Somit ist die erforderliche Inkubation für mindestens 16 Stunden, die zur Bestimmung der Dauer der Symptome eines zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen, das Verfahren macht. Zusätzlich ist eine Voraussetzung Kontakt von Effektorzellen zu gewährleisten und Zielzellen jeweils und exprimiert eine zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen zu erhalten, gemäß dem Verfahren-Prototyp ist der relativ hohe Verhältnis zwischen den mononukleären Zellen und Zielzellen (50: 1). Die Umsetzung in der Praxis dieser Bedingung macht es erforderlich, mit einem relativ großen Volumen an Blut zu arbeiten, was wiederum die Möglichkeit, aus dem Patienten Blut zu erhalten, für die Untersuchung des Fingers verhindert (nur das venöse Blut verwendet wird).

Während der Inkubation von mononukleären Zellen und Tumorzielzellen durch cytotoxische Wirkung der Änderung Permeabilität mononukleären Zellmembranen der Zielzellen, was in der Freisetzung von 51 Cr - Zielzellen. Aber auch bei der Methode des Prototyps Verfahren bereitgestellt, und die Bedingungen optimal Inkubationsmischung in Abwesenheit von Zieltumorzellen hochspezifische Rezeptoren spezifische Mediatoren von Effektorzellen in einigen Fällen zu einer unzureichenden Expression von funktionellen Zielzellen Veränderungen während der zytotoxischen Reaktion führen zu vermischen.

Insbesondere erhöhte Permeabilität der Zellmembran ausreichend sein kann , 51 Cr freizugeben (nach Ansicht der Autoren der Erfindung ist eine Mischung aus 40-80% der Zielzellen mit intakten Membranen). In diesen Fällen gibt es einen relativ geringen spezifischen ( das heißt aufgrund der zytotoxischen Wirkung von einkernigen Zellen) in einer Ausbeute von 51 Cr Experiment sein , dass eine zytotoxische Reaktion lozhnozanizhennyh Ergebnisse produzieren wird. Ferner bei Verwendung von 51 Cr als Index der zytotoxischen Wirkung einer Reihe von Gründen (Qualitätszielzelle Inkubationsmedium und Qualität Kochgeschirr, unzureichend qualifiziert Krankenschwestern, etc.) auftreten können erhöhte spontane (unspezifisch) Ausbeute des Radionuklids in der Steuerung (16-50%). Dies macht es schwierig , wegen der cytotoxischen Antwort zu nehmen, lozhnozanizhennye Ergebnisse der Bestimmung verursacht, und in einigen Fällen (spontane Freisetzung 51 Cr in der Kontrolle von mehr als 20%) macht die Rechnungsergebnisse der Reaktion praktisch unmöglich ist.

Die relativ niedrigen Festigkeitseigenschaften von Zieltumorzellmembranen führt zu einer relativ hohen Wahrscheinlichkeit von Schäden an diesen Zellen durch Pipettieren, Zentrifugieren (auf der Stufe der Herstellung der Zielzellen), so dass die Lösungen in einem Gemisch aus mononukleären Zellen und den Zielzellen und dergleichen. D. Dies wird in einem relativ hohen reflektierten spontane (nicht-spezifische) -Ausgang von 51 Cr in dem Versuch, der nach den Erfindern, können in einigen Fällen 30 bis 40% zu erreichen, die auf die Bestimmung lozhnozavyshennym Ergebnissen führt. All dies führt zu einer relativ geringen Genauigkeit der SCC über den Prototyp-Methode. Schließlich umfasst das Verfahren nach dem Prototyp Verfahren bereitgestellt [4] 51 Cr - Anwendung mit dem Material arbeiten, das Radionuklid markiert, das erfordert eine speziell ausgestattetes Labor und geschultes Personal.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um die RCC Bestimmung der Möglichkeit Supravital Bereitstellung frühen und Schwere der morphologischen Manifestationen der zytotoxischen Wirkung der Ausschluss der Möglichkeit einer spontanen Zielzellenlyse, mechanische Schäden an ihren Membranen und spontane Freisetzung eines radioaktiven Isotops der Zielzellen durch die Verwendung von Zellen mit spezifischen, empfindlichen Rezeptoren spezifische Mediatoren durch menschliche zytotoxische Zellen, große zytoplasmatische Granula fähig Exozytose und eine relativ hohe mechanische Festigkeit der Membranen hergestellt.

Das Problem wird gelöst durch ein Verfahren für die SCC Bestimmung, die Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Patienten peripherem Blut umfasst, Herstellung von Zielzellen, Mischen von mononukleären Zellen und Zielzellen, die Inkubation von mononukleären Gemischs und Ziel durch Licht der cytotoxischen Antwort gefolgt Zellen gemäß der Erfindung als eine Zelle -misheney verwendet Mastzellen von Ratten. Mischungsmastzellen und mononukleären Zellen von Ratten in einem Verhältnis von 20-30: 1 liegt. Direkt nach mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten Mischen resultierenden Mischung wurde weiter zentrifugiert. Das Inkubationsgemisch von mononukleären Zellen und Mastzellen innerhalb von 30 Minuten hergestellt Ratten. Zur Berücksichtigung der zytotoxischen Reaktion teilnehmen wird durch Zählen der Anzahl von degranulierten Mastzellen von Ratten als Prozentsatz der Gesamtzahl der Ratten-Mastzellen und mononukleären Zellen in einer Mischung aus Mastzellen und Ratte bei einem Wert des Index von weniger als 25%, bestimmt durch SCC ausgeführt verringert, wobei ein Wert des Index 25-35% bestimmen die normale SCC, und einen Wert des Index von mehr als 35% die erhöhte SCC bestimmen. Die am wirksamsten, wenn die Abrechnungsergebnisse in einer cytotoxischen Reaktion unmittelbar bevor die Anzahl der degranulierten Mastzellen von Ratten in einer Mischung von einkernigen Zellen und Ratten-Mastzellpellet Herstellung und Rühren der Mischung des Überstands von mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten zu zählen.

Auswählen des optimalen Modus und Bedingungen zur Durchführung des beanspruchten Verfahrens, die größte Wirksamkeit der Erfindung in ihrer Umsetzung zu gewährleisten, wie folgt durchgeführt.

diagnostisch signifikanten Bereich der zytotoxischen Aktivität von menschlichen Blutzellen in normalen und pathologischen vergleichenden Studien von SCC herzustellen bei diesen Patienten durchgeführt wurden:

- Bei gesunden Kindern;

- Mängel bei Kindern mit antivirale Immunität, die bekannt ist [3, 6, 7], ist ein Beweis für reduzierte normalen Funktionen von Killer - die wichtigsten Zellen für SCC verantwortlich;

- Bei Kindern mit schweren reaction "graft versus host" klinisch manifestierten Abstoßung des transplantierten Gewebes, die bekannt sind [1, 6, 3], aufgrund einer signifikanten Erhöhung der Aktivität von zytotoxischen Zellen.

Die Verteilung der Patienten durch Gruppen war wie folgt:

I-Gruppe - praktisch gesunde Kinder von 3 bis 16 Jahren - 26 Personen;

Gruppe II - Kinder (im Alter von 3 bis 16 Jahre) mit häufigen akuten respiratorischen Viruserkrankungen / SARS / (mehr als 8 mal pro Jahr), durch eine virologische Untersuchung Verfahren bestätigt (Immunfluoreszenzanfärbung Abstrichen - Abdrücke von der Schleimhaut der Nase und Rachen, die Studie Seren auf Antikörper gegen die respiratorische Viren gepaart) - 31 Personen.

Gruppe III - brennen Patienten (im Alter von 3 bis 16 Jahre) mit einer Krise der Abstoßung des transplantierten Hautlappen - 6 Personen.

SCC in jeder dieser Gruppen wurden unter Verwendung des Verfahrens nach und den Prototyp-Verfahren bestimmt [4]. Im Zuge der SCC der Bestimmung und des beanspruchten Verfahrens und der Prototyp Methode, um die Angemessenheit der Bedingungen der Experimente Blut des Patienten zu gewährleisten, wurde in drei parallelen Experimenten mit drei parallelen Kontrollen (3 Versuche und drei Kontrollproben) untersucht. In den RCCs Bestimmung wie bei dem Verfahren der Prototyp-Aktivitätstest und Kontrollproben beschrieben wurden auf einem Radioaktivität Zähler "Ultra-Gamma 1280" gemessen (hergestellt von LKB, Schweden).

Statistische Verarbeitung der durch die Berechnung sigmalnogo Abweichung erzeugt Ergebnisse (s), sondern auch durch präzise Berechnung von Aktien der Signifikanz der Unterschiede durch das Verfahren j (Ecke Fisher - Transformation) [8].

Vergleichsstudien SCC Gruppe I - III sind in Tabelle 1 gezeigt.

Die Daten in Tabelle 1 zeigt , dass bei gesunden Patienten (Gruppe I) die Anzahl der degranulierten Mastzellen von Ratten in der Mischung der Gesamtzahl von mononukleären Zellen und den Zielzellen von Ratten - Mastzellen (% Degranulation), durchschnittlich (30 ± 2,5)% durch Variieren Werte angegebenen Index im Bereich von 25-35%. Dieses Intervall ist als ein Wertebereich angenommen, die die normale RCC charakterisieren. In der Gruppe II - Patienten (mit einer bestätigten Reduktion Funktion von zytotoxischen Zellen) Degranulation% gemittelt (18 ± 3,0) mit Swing - Werte angegebenen Index im Bereich von 12-24% (p <0,001 im Vergleich zu denen in der Gruppe I) erhalten haben . In dieser Hinsicht wurde entschieden, dass der Indikator SCC% Degranulation von weniger als 25% reduziert wird. In Gruppe III - Patienten (mit einer erhöhten Aktivität von zytotoxischen Zellen bestätigt wird ) basierend auf dem Mittelwert Degranulation% erhalten, gleich (45 ± 4,0)% und die Grenzen seiner Abweichung 37-53% (p <0,001 im Vergleich zu denjenigen , erhalten in Gruppe I), wurde beschlossen, dass die erhöhte SCC auf einen Wert festgestellt werden kann, der Index von mehr als 35%.

Tabelle 1 und zeigen, dass der SCC bei der Bestimmung durch das Verfahren Prototyp-Methode [4] Die Erfinder SCC-Werte wurden erhalten, die mit den von den Autoren Prototyp-Methode in der zitierten Arbeit präsentierten Daten vergleichbar sind. ein Autor der Erfindung zum Beispiel, wie in der durchschnittlichen Höhe des Prototyps Methode SCC bei gesunden Patienten war (54 ± 4)% beschrieben; die Autoren der gleichen Periode war (53,6 ± 3,7)% nach der Prototyp - Methode. Die Korrelation SCC-Werte nach dem Verfahren Prototyp-Verfahren bestimmt [4], die Erfinder und Schöpfer Prototyp-Verfahren wurde für Patienten mit höheren und niedrigeren SCC beobachtet, insbesondere bei Patienten mit einer Krise der Transplantatabstoßung (siehe. Abbildung 6 in Tabelle 1 der Beschreibung, und 65 Tabelle auf den Seiten. 162 beschreibt Prototyp-Methode [4]).

Um das optimale Verhältnis von mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten in der Mischung bestimmen, untersuchten wir die Wirkung von unterschiedlichen Verhältnissen auf der Genauigkeit der SCC. Für die Studie wurden vorselektierten 10 gesunden Kindern (im Alter von 3 bis 16 Jahre), in dem die SCC-Werte im Bereich 28-32% lagen. Jeder der Patienten wurde von SCC in Verhältnissen von mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten in den Mischungskomponenten bestimmt: 5: 1, 10: 1, 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1. Somit wird jeder der Patienten Blut mit jedem Test und das Verhältnis mononukleären Zielzellen beansprucht wurde in dreifacher Ausführung mit drei parallelen Kontrollen (3 Versuchs- und Kontrollproben 3) getestet. Jede der getesteten Beziehungen zu anderen fest optimalen Bedingungen und Bedingungen für die Durchführung des beanspruchten Verfahrens.

Statistische Verarbeitung der Ergebnisse wurde in ähnlicher Weise für die Verarbeitung der Ergebnisse von Experimenten ausgeführt, um die Bereiche von SCC diagnostisch signifikant in normalen und pathologischen Bedingungen zu etablieren.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Aus Tabelle 2 folgt, daß das optimale Verhältnis von mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten in der Mischung von 20-30: 1, wie Es stellt dieses Verhältnis höchsten Prozentsatz Zielzellen empfindlich gegenüber der zytotoxischen Wirkung von mononukleären Zellen gezielt beschädigt wird, mit minimaler Streuung der Ergebnisse von Experimenten, in parallel. Bei niedrigeren Verhältnissen zwischen den angegebenen und mononukleäre Zellen zu Zielzellen (5-15: 1) gibt es einen geringeren Prozentsatz an degranulierten Zielzellen (5-18%), was darauf hindeutet, dass alle Zielzellen nicht empfindlich gegenüber den zytotoxischen Zellen wurden Zytolyse unterworfen. Bei höheren (im Vergleich mit dem Optimum) und mononukleäre Verhältnis der Zielzellen (30-50: 1), trotz der Tatsache, dass alle Zielzellen, die für die zytotoxische Wirkung von mononukleären Zellen empfindlich sind, unterzogen, um die Zytolyse (30-32%), gibt es eine relativ große Streuung der Ergebnisse in parallelen Experimenten. Letztere kann offenbar auf dem Inkrafttreten von mechanischen oder anderen Faktoren zurückgeführt werden, um den Kontakt zytotoxische Zellen und Zielzellen, oder zytotoxische Mediatoren, die sich negativ auf die Reproduzierbarkeit der Reaktion beeinträchtigt und verringert somit die Genauigkeit der SCC.

Um die Relevanz Zentrifugationsschritt kombinierte Wirkung des beanspruchten Verfahrens und die optimale Zeit der Inkubation etablieren und untersucht den Einfluß der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zentrifugationsschritt in Kombination mit verschiedenen Inkubationszeiten bei der Genauigkeit der SCC. Für die Versuche wurde als Standardmodus Zentrifugation (10 Minuten bei 600 g) gewählt wird, gegen die peripheren mononukleären Blutzellen empfohlen [7]. Für die Studie wurden vorselektierten 10 gesunden Kindern (im Alter von 3 bis 16 Jahre), in dem die SCC-Werte im Bereich 28-32% lagen. Jeder der Patienten wurde von der SCC in der Gegenwart und in der Abwesenheit von Zentrifugationsschritt in dem beanspruchten Verfahren, die Sequenz von Aktionen bestimmt und die Inkubationszeiten jeweils reichten von 15 bis 240 Minuten bei anderen fest optimalen Bedingungen und Bedingungen zur Durchführung des beanspruchten Verfahrens. Jede Patientenblut in jeder experimentellen Formulierungsvarianten in drei parallelen Tests mit drei parallelen Kontrollen (3 Versuche und drei Kontrollproben) untersucht.

Statistische Verarbeitung der Ergebnisse wurde in ähnlicher Weise für die Verarbeitung der Ergebnisse von Experimenten ausgeführt, um die Bereiche von SCC diagnostisch signifikant in normalen und pathologischen Bedingungen zu etablieren.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Zuvor haben die Erfinder Eignungsprüfung wurde in Übereinstimmung mit den empfangenen Empfehlungen von [7] für den Zweck des Zentrifugierens Regime beanspruchten Verfahren durchgeführt. Somit als Ergebnis von Experimenten wurde gefunden, daß, einerseits, indem die Mischung von mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten in dem obigen Modus auf die Unterseite 100% mononukleären Röhrchen absetzen Zentrifugieren und 100% der Zielzellen, die durch das Fehlen der genannten Zellen in dem Überstand (Überstand) wurde bestätigt, nach Zentrifugation. Auf der anderen Seite, während der Zentrifugation in der angegebenen Betriebsart praktisch keine mechanische Beschädigung von Zielzellen, insbesondere deren Membranen. Es wurde bestätigt, dass zum einen die Anzahl der Einträge in der Zielzelle und nach der Zentrifugation konstant bleibt; Zweitens wird die Kontrollproben (ohne mononukleären Zellen) Ratten-Mastzellen-Degranulation durch Zentrifugation (bei optimalen Inkubationszeit) praktisch nicht beobachtet (die Anzahl der degranulierten Zellen nach Zentrifugation der Kontrolle war 0%). In diesem Zusammenhang sagte das Regime als Arbeits erlassen wurde (im Folgenden - die "Arbeits Zentrifugation Modus").

Die Daten in Tabelle 3 zeigen, dass in Abwesenheit von Zentrifugationsschritt in dem beanspruchten Verfahren wird die Folge von Aktionen mit einem Kurzzeit-Inkubation (15-60 min), wird eine zytotoxische Wirkung auf Zielzellen beansprucht fast, dass die Möglichkeit ausschließt, die SCC zu bestimmen. Mit zunehmender Inkubationszeiten über 60 min zytotoxischen Effekt erhöht, aber der Anteil geschädigter spezifischen Zielzellen empfindlich gegenüber der zytotoxischen Wirkung von einkernigen Zellen ist relativ gering (12-21%), was die genaue Schätzung SCC verhindert. Zusätzlich kann, wenn über 60 min Inkubation Prozess Timing erhöht spontane Degranulation von Mastzellen von Ratten (Anzahl der degranulierten Zellen in 3-20% der Kontrolle in Abhängigkeit von der Inkubationszeit). Somit zeigen diese experimentellen Ergebnisse, daß in der Abwesenheit von Zentrifugationsschritt Ergebnisse cytotoxischen Antwort Bilanzierung praktisch unmöglich ist.

Aus Tabelle 3 kann man die Mischung aus mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten in der Kombination durch Inkubationsmischung maximale spezifische Schädigung der genannten Zielzellen empfindlich gegenüber den zytotoxischen Zellen erhalten wird, beginnend mit 30 Minuten Inkubationszeit gefolgt gesehen, und dass die Zentrifugation Betrieb werden. Da diese minimale Abweichungen beobachtet in parallelen Experimenten Ergebnisse Inkubationszeit angegeben als optimal angenommen. Durch Erhöhung bleibt die Periode der Inkubationsmischung (45-120 min) Anzahl der degranulierten Zielzellen im wesentlichen konstant ist, jedoch zu einer erhöhten Streuung Parallelversuchen. Letzteres ist aufgrund des Prozesses der spontanen Degranulation von Mastzellen in Ratten (als Erstmanifestation unspezifische Lyse der Zellen) zu beginnen, wie in der Kontrollgruppe durch Erhöhung der Degranulation% belegt (1-3%). Dadurch verringert sich die Reproduzierbarkeit der zytotoxischen Reaktionen und dementsprechend die Genauigkeit der SCC.

Mit weiterer Zunahme der Inkubationsdauer Mischung (über 120 Minuten), gibt es eine signifikante Zunahme in der Anzahl der degranulierten Mastzellen von Ratten in der Steuerung (11-22%), die die wachsenden unspezifische Zelllyse Prozessen anzeigt. Dies führt zu einer deutlichen Unterschätzung der Ergebnisse der zytotoxischen Reaktionen, die folglich Bestimmung von SCC ausschließt. Somit schlägt die Analyse der experimentellen Ergebnisse gezeigt in Tabelle 3, daß die Mischung aus einkernigen Zellen durch Zentrifugation und Ratten-Mastzellen ist ein wesentliches Merkmal des beanspruchten Verfahrens, wie der Schritt (ein Verfahren zu seiner Verfügbarkeit Sequenz) direkt die Erreichung der behaupteten Wirkung beeinflussen. Diese Mischung ist eine Kombination von Zentrifugation seine Inkubation folgte die Auswahl der optimalen Inkubationszeit (30 min) ermöglicht, so dass die höchste Genauigkeit der SCC zu erhalten.

Zum Vergleich haben die Erfinder Experimente durchgeführt, die Möglichkeit der Einführung eines Zentrifugationsschritt Reihe von Aktionen Prototyp-Methode [4] zu bewerten. Zur gleichen Zeit überprüfte ich die Eignung von zwei Standard-Zentrifugation Regime:

- Modus empfohlen gegen Tumorzellen der myeloischen Linie nach dem Verfahren Prototyp-Verfahren [4] (5 min bei 150 g) - 1-Modus;

- Mode empfohlen gegen die peripheren mononukleären Blutzellen [7] (für 10 min bei 600 g) - 2-Modus (Arbeitsmodus Zentrifugation bei dem erfindungsgemäßen Verfahren).

Es wurde gefunden, daß Zentrifugation in Modus 1 führt zu unzureichender Absetzen von mononukleären Zellen - in dem Überstand von mononukleären Zellen 15-30% betrug, was auf die endgültigen Verletzung Verhältnis mononukleären Zellen und Zielzellen in der Prototyp-Verfahren führte die Mischung, was wiederum die Genauigkeit des SCC reduziert. Weiterhin spontane 51 Cr - Ausbeute erhöht in der Kontrolle auf 25-30%, einen erheblichen Teil mechanische Beschädigung von Zielzellen (insbesondere deren Membranen) , die während der Zentrifugation. Diese negativen Faktoren kombinieren, um die Möglichkeit auszuschließen, von der SCC zu bestimmen. Zentrifugierung im Modus 2 ist es praktisch unmöglich , die Ergebnisse der zytotoxischen Reaktion des hoch (50-60%) der spontanen 51 Cr - Freisetzung in der Steuerung zu berücksichtigen, die anzeigt , dass die überwiegende Mehrheit von mechanischen Schäden an der Zielzelle (insbesondere deren Membranen) während der Zentrifugation. Somit Verabreichung Zentrifugation (wie in Modus 1 und Modus 2) zu der Prototypsequenz Prozessschritt resultierte in Unmöglichkeit der Bestimmung SCC wie in dem Prototyp beschriebenen Verfahrens.

Erreichen technische Wirkung durch die Erfindung aufgrund der folgenden. Es ist bekannt, dass unter dem Einfluss der Ratten-Mastzellen-Degranulation serum-sensibilisierte vorge Patienten Allergenen auftritt. Morphologisch ist es Verlassen der zytoplasmatischen Granula Zelle gezeigt, die Berücksichtigung der Degranulationsprozeß unter dem Mikroskop groß genug sind, zu übernehmen. Diese Sensibilisierung von Mastzellen von Rattenblutserum des Patienten im Verlauf der Ursache signifikante allergen Bestimmung ist ein notwendiger Schritt für die Degranulation Reaktion [9]. Letzteres ist aufgrund der Tatsache, dass die zunächst auf der Oberfläche von Mastzellen in Ratten fehlt allergen-spezifischem Immunglobulin E (IgE) Person, die für den Aufbau und das Funktionieren des Rezeptorkomplexes, die für die Reaktion auf das Allergen.

Die Autoren erklärten keine Lösung gefunden Quellen von Informationen, die Veränderung der Mastzellen bei Ratten während zytotoxische Reaktionen beschrieben werden würde. Die Erfinder haben experimentell festgestellt, dass die Umsetzung der deklarierten Menge von Aktionen unter optimalen Bedingungen und Modi ihrer Umsetzung unter dem Einfluss von zytotoxischen einkernigen Zellen von Ratten Degranulation von Mastzellen geschieht ohne vorherige Sensibilisierung des Blutserum des letzten Patienten, die eine Manifestation antitelonezavisimoy zelluläre Zytotoxizität ist. Nach Ansicht der Autoren des vorgeschlagenen Verfahrens kann dies auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass fettleibige Ratten anfänglich Zellen durch zytotoxische humanen mononukleären Zellen produziert spezifische Rezeptoren an spezifische hochempfindliche Perforin und Zytokine sind. Es ist auch möglich, dass die zytotoxische mononukleären Zellen in der Lage spezifische Zytokine produzieren richtungs die Rezeptoren beeinflussen und / oder Mastzellen-Membranen von Ratten. Daher wird für die Errichtung und das Funktionieren des Rezeptorkomplexes, empfindlich auf die zytotoxische Wirkung von Effektor-Zellen, ist es nicht vor erfordern Sensibilisierung erklärte Zielzellen Blutserum des Patienten.

Die Ergebnisse der experimentellen Untersuchungen durch die Erfinder haben gezeigt, dass Ratten-Mastzellen-Degranulation in zytotoxische Reaktionen gezeigt manifestiert morphologisch Exozytose - an die Oberfläche Ausgang der transparenten Zelle Granulat ausreichend groß ist, deutlich unterscheidbar unter dem Mikroskop. Es wurde festgestellt, dass die Co-Inkubation der Zielzellen in den angegebenen Zeitraum Effektorzellen Zeit und erklärt (30 Minuten) führt nicht zum Tod der Zielzellen. All dies ermöglicht Supravital morphologische Veränderungen Rattenmastzellen zu halten - durch die Wirkung von zytotoxischen Degranulation von menschlichen Zellen. Die Fähigkeit, die Ergebnisse von zytotoxischen Reaktionen auf die morphologischen Veränderungen der Zielzellen, die wiederum zu bewerten, entfällt die Notwendigkeit für das letztere radioaktive Isotopenmarkierung. Diese, die einerseits vermeidet die Notwendigkeit berücksichtigt, die Fähigkeit der Zielzellen für die spontane Freisetzung in Abwesenheit des Radionuklids auch Effektorzellen und dadurch ermöglicht, nehmen eine optimale Steuerung der Reaktion und erhöht dadurch die Genauigkeit der SCC. die Analyse durchzuführen in einem speziell ausgestatteten für die Arbeit mit radioaktiven Isotopen Labor und mit der Teilnahme von speziell geschultem Personal Auf der anderen Seite, wodurch die Notwendigkeit eliminiert wird.

Наличие у заявленных клеток-мишеней особых специфических высокочувствительных рецепторов к действию клеток-эффекторов обеспечивает возможность раннего проявления выраженного цитотоксического эффекта даже при минимальных количествах перфоринов и цитокинов, продуцируемых мононуклеарами. Это позволяет получить значимый цитотоксический эффект и соответственно обеспечить относительно высокую точность определения при относительно низком соотношении клеток-эффекторов и заявленных клеток-мишеней (20-30:1). В результате появляется возможность проведения качественного анализа при использовании относительно небольшого количества крови, что дает возможность получения крови для исследования не только из вены, но и из пальца пациента.

Введение в совокупность действий заявленного способа дополнительной (по сравнению с прототипом) стадии - центрифугирования смеси мононуклеаров и клеток-мишеней - позволяет обеспечить ускоренное осаждение клеток, способствуя достижению более раннего и более тесного контакта между

клетками-эффекторами и клетками-мишенями и соответственно более раннему продуцированию и высвобождению цитотоксических медиаторов клеток-эффекторов и их воздействию на клетки-мишени.

При этом авторами изобретения экспериментально установлено, что степень механического повреждения мембран тучных клеток крыс в результате центрифугирования в рабочем режиме недостаточна для спонтанной дегрануляции указанных клеток, что подтверждалось практически полным отсутствием (0%) дегранулировавших клеток в контроле (при оптимальном режиме инкубации). Напротив, при центрифугировании используемых в способе-прототипе опухолевых клеток миелоидной линии механические повреждения значительной части этих клеток (в частности их мембран) отмечались даже при использовании режима (5 мин при 150g), рекомендованного для данных клеток методикой способа-прототипа [4] (спонтанный выход 51 Сr в контроле 25-30%). При центрифугировании в режиме (10 мин при 600g), рекомендованном для мононуклеаров периферической крови [7] (рабочий режим заявленного способа), механические повреждения клеток-мишеней становились еще более значимыми (спонтанный выход 51 Сr в контроле 50-60%). Таким образом, результаты сравнительных экспериментальных исследований авторов изобретения (приведенные выше) свидетельствовали о том, что при использовании заявленных клеток-мишеней (в отличие от клеток-мишеней способа-прототипа) центрифугирование не оказывает значимого негативного влияния на точность определения СКЦ, что обусловлено относительно высокой механической прочностью мембран тучных клеток крыс.

Использование в качестве клеток-мишеней тучных клеток крыс, обладающих особым специфическим рецепторным аппаратом и прочностными характеристиками мембран, позволяющими искусственно ускорить процесс осаждения клеток, в сочетании с включением центрифугирования (как дополнительной по сравнению с прототипом стадии) в совокупность действий заявленного способа обусловливают возможность получения выраженного цитотоксического эффекта при относительно коротких сроках инкубации (30 мин). Заявленные сроки инкубации в свою очередь позволяют исключить возможность неспецифического лизиса тучных клеток крыс, начальные проявления которого в виде спонтанной дегрануляции клеток отмечаются при сроках инкубации 45-60 мин и достигают значимых величин через 2-3 час инкубации. Это и вносит существенный вклад в повышение точности определения СКЦ.

Перемешивание клеточного осадка и супернатанта смеси мононуклеаров и тучных клеток крыс, осуществляемое непосредственно перед подсчетом количества дегранулировавших клеток-мишеней, позволяет разрушить образовавшиеся при центрифугировании конгломераты клеток смеси, что облегчает морфологическую оценку результатов реакции - подсчет дегранулировавших тучных клеток крыс под микроскопом. Это способствует дополнительному повышению точности определения СКЦ.

Таким образом, морфологические и функциональные особенности заявленных клеток-мишеней (наличие особого специфического рецепторного аппарата, специфические характеристики цитоплазматических гранул, прочностные характеристики мембран), наличие дополнительного действия (центрифугирования), а и заявленные (оптимальные) режимы и условия осуществления действий способа (смешивания мононуклеаров и клеток-мишеней, инкубации) в совокупности обеспечивают возможность учета суправитальных морфологических изменений клеток-мишеней (их дегрануляцию), специфически обусловленных действием цитотоксических клеток человека.

В результате заявленная совокупность признаков в их взаимосвязи позволяет добиться суправитального раннего и выраженного морфологического проявления цитотоксического эффекта при исключении эндогенных и экзогенных значимых негативных факторов, непосредственного влияющих на учет результатов цитотоксической реакции (спонтанного лизиса клеток-мишеней, механических повреждений их мембран, спонтанного выхода радиоактивного изотопа из клеток-мишеней). Это в свою очередь позволяет повысить точность определения СКЦ, сократить сроки проведения анализа, исключить необходимость работы с радиоактивным изотопом. При этом из известного уровня техники не выявляется, по мнению заявителя, влияния предписываемых изобретением преобразований, характеризуемых отличительными от прототипа существенными признаками, на достижение технического результата.

Das Verfahren ist wie folgt. Der Patient oder die Finger von der Vene, wird Blut in einer Menge von 0,5 ml in das Teströhrchen, getränkte Heparin entnommen. Entnommen aus peripheren mononukleären Blutzellen durch Standardverfahren isoliert, wie beschrieben in [7]. Wenn dieses Blut zweimal mit einer Lösung von 0,9% NaCl verdünnt wird, wurde das Gemisch über Ficoll-Packung 1077 geschichtet g / cm 3 und 30 min bei 400 g zentrifugiert. Gebildet in Interphase "Ring" von mononukleären Zellen mit einer Pipette entfernt wurde, wurde die resultierende Zellsuspension dreimal mit 0,9% NaCl gewaschen und auf eine Konzentration von 2x10 6 Zellen / ml eingestellt. Mastzellen werden durch die Verfahren hergestellt Ratten LM Ishimova und LI Zelichenko [9]. Wenn diese weiße männliche Ratten mit einem Gewicht von 140 g werden unter Äthernarkose und injiziert in die Bauchhöhle geopfert wird auf eine Temperatur von 37 o C Hemotsell Medium in einer Menge von 5,3 ml. Produzieren Rattenbauchmassage für 2-3 Minuten, wonach der Bauchhöhle wird geöffnet und der Flüssigkeitsschichten aus Rattenmastzellen werden in einem Gefäß gesammelt , vorerhitzt auf eine Temperatur von 37 ° C wurden die Zellen dreimal mit Medium 199 , und die Zellkonzentration gewaschen eingestellt bis 1x10 5 Zellen / ml . Danach Pilotzentrifugenröhrchen Aufschlämmung mononukleären 25-38 & mgr; l und 25 & mgr; l Suspension von Ratten-Mastzellen (Verhältnis von mononukleären Zellen und Zielzellen in experimentellen Proben entspricht 20-30: 1) machen. Die Steuerung wird Zentrifugenröhrchen 25 & mgr; l Suspension von Ratten - Mastzellen und 25-38 ul des Mediums 199. Versuchs- und Kontrollröhrchen wurden für 10 min bei 600 g, dann 30 Minuten bei 37 o C in einem Inkubator inkubiert und zentrifugiert platziert gemacht

Nach der Inkubation wurden die Inhalte in den Test- und Kontrollröhrchen geschüttelt, um das Zellpellet und Überstand (Überstand) zu agitieren. Die Zellsuspensionen der Test- und Kontrollröhrchen werden auf Glasobjektträger übertragen (aus jedem Röhrchen - an einem separaten Glas), die zuvor mit einer alkoholischen Lösung von Neutralrot beschichtet. Tropfen von Zellsuspensionen der Test- und Kontrollproben, platziert auf Glasplatten, decken Sie die obere Abdeckung Gläser, die mit Vaseline geschmiert werden, um die Kante (zur Flüssigkeitsverdampfung zu verhindern). Zu berechnen, beispielsweise unter dem Mikroskop bei 15h25, die Anzahl der degranulierten Mastzellen von Ratten als Prozentsatz der Gesamtzahl der Ratten-Mastzellen in der Versuchsprobe und einer Kontrollprobe (im Folgenden - bzw. "% Degranulation im Experiment" und "% Degranulation in control"). SCC wird als die Differenz in der Erfahrung der Degranulation% und Degranulation% in der Kontrolle (- "% Degranulation" bezeichnet) definiert. Wenn der Wert von% Degranulation von weniger als 25, eine reduzierte SCC bestimmt, ein Wert des Index 25-35% der normalen SCC bestimmt und ein Wert des Index von mehr als 35% die erhöhte SCC bestimmen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1.

Alesha K., 7 Jahre. Es wurde im Rahmen eines Screening-Programm zur Identifizierung Prädisposition für gemeinsame Atemwegserkrankungen in Kinderklinik im Kinder City Hospital 1 St. Petersburg (DGB 1) untersucht. In der Geschichte des Patienten festgestellt, eine seltene SARS (1-2 mal pro Jahr). Bei der Dispensary Prüfung der Pathologie der inneren Organe sind nicht offenbart.

Der Patient wurde SCC identifiziert, die beanspruchte Verfahren. In das Kind den Finger vom Blut bei 0,5 ml pro Fläschchen genommen Bestimmung, befeuchtet mit Heparin. Entnommen aus peripheren mononukleären Blutzellen durch Standardverfahren isoliert [7]. So wurde das Blut zweimal mit einer Lösung von 0,9% NaCl verdünnt, die Mischung wurde über Ficoll geschichtet Pack 1,077 g / cm 3 und 30 min bei 400 g zentrifugiert. Gebildet in Interphase "ring" einkernige abpipettiert wurde die resultierende Zellsuspension dreimal mit 0,9% NaCl - Lösung gewaschen und die Konzentration wurde auf 2x10 6 Zellen / ml eingestellt. Hergestellt durch Verfahren Ratte L.M.Ishimovoy LI und Mastzellen Zelichenko [9]. Wenn diese weiße männliche Ratten 140 g unter Etheranästhesie anästhesiert Wiege- und wurde in die Bauchhöhle injiziert wird auf eine Temperatur von 37 o C Hemotsell Medium in einer Menge von 3,5 ml.

Hergestellte Rattenbauchmassage für 2-3 Minuten, wonach die Bauchhöhle geöffnet wurde , und eine Flüssigkeitsschicht durch die Schicht aus Rattenmastzellen wurden in einem Gefäß gesammelt, auf eine Temperatur von 37 o C wurden die Zellen dreimal mit Medium 199 , und die Zellkonzentration wurde auf 1x10 5 Zellen / ml eingestellt , . das Blut des Patienten wurde in Dreifachversuche mit drei parallelen Kontrollen getestet (3 Versuche und drei Kontrollröhrchen.). In jedes Röhrchen experimentelle Zentrifuge 25 & mgr; l Suspension von mononuklearen Zellen und 25 & mgr; l Suspension von Ratten-Mastzellen (Verhältnis von mononukleären Zellen und Mastzellen in Ratten experimentellen Proben entsprach 20: 1) zugegeben. In jedem Steuer wurde Zentrifugenröhrchen 25 & mgr; l Ratten - Mastzellsuspension zugegeben und 25 ul des Mediums 199. Die Test- und Kontrollröhrchen wurden bei 600g für 10 min zentrifugiert, dann in einen Inkubator gelegt und für 30 Minuten bei 37 o C inkubiert

Nach der Inkubation wurden die Inhalte in den Test- und Kontrollröhrchen geschüttelt, um das Zellpellet und den Überstand zu agitieren. Die Zellsuspensionen von Test- und Kontrollröhrchen auf Glasobjektträger übertragen (aus jedem Röhrchen - an einem separaten Glas), die zuvor mit einer alkoholischen Lösung von Neutralrot beschichtet. Tropfen von Zellsuspensionen der Test- und Kontrollproben, platziert auf Glasträger, geschlossen, um die obere Abdeckung Gläser, deren Ränder mit Vaseline eingefettet wurden. Mit Hilfe eines Mikroskops "BIMAM P-11" (hergestellt von "LOMO", St. Petersburg) berechnet (zunehmende 15h25) in jeder der experimentellen Proben und Kontrollproben 100 Ratten-Mastzellen; einer von ihnen zeigte degranulierten Fettrattenzellen; die Anzahl der degranulierten Mastzellen der Ratten wurde als 100% der berechneten Ratten-Mastzellen (% jeweils in dem Experiment und Degranulation Degranulation% in der Kontrolle) (s. Tabelle. A) ausgedrückt.

SCC bestimmt als die Differenz in der Erfahrung der Degranulation% und in der Kontrolle von Degranulation% in jedem der Paare (% Degranulation I,% Degranulation II,% Degranulation III):

Degranulation% I = 28%

% Degranulation II = 30%

% Degranulation III = 29%

Wir berechnen den Durchschnitt (von 3 Proben) SCC - Wert (% degranulation Mi):

Degranulation% Mi. = 29%

Der erhaltene Wert der SCC (29%) fällt in den Bereich der normalen Werte der SCC, SCC machte es möglich, dies als normale Patienten zu betrachten. die Zeit nehmen, den Vorgang für 2 Stunden und 5 Minuten (2,08 Stunden) (entsprechend der Zeitsteuerung der Erfinder) zu bestimmen.

Parallele Bestimmung von SCC wurde mit der Prototyp-Verfahren durchgeführt, wie beschrieben in [4]. In diesem Blut des Patienten wurde in dreifacher Ausfertigung Experimente mit drei parallelen Kontrollen (3 Versuche und drei Kontrollproben) getestet. Die Aktivität der Versuchs- und Kontrollproben wurden mit einem Radioaktivität Zähler "Ultra-Gamma 1280" gemessen (hergestellt von LKB, Schweden). Die durchschnittliche (von 3 Proben) SCC-Wert (% Lyse), die durch die Formel in dem Verfahren angegeben definiert sind [4], betrug 55,2%, was auf der Ebene der Norm Prototypverfahren entsprach. Die Dauer des Verfahrens war die Definition von 89 Stunden und 10 Minuten (89,2 Stunden) (entsprechend der Zeitsteuerung der Erfinder).

Somit ist, wie der Wert der SCC hergestellt des beanspruchten Verfahrens und den Prototyp-Verfahren, fielen mit den entsprechenden Intervallen von Werten, die die normale RCC charakterisieren. Dies wird durch die Ergebnisse einer klinischen Untersuchung des Kindes bestätigt, aber auch Beobachtungen von ihnen in der Dynamik innerhalb von 2 Jahren (2 Jahre altes Baby 1 Mal krank Rhinovirusinfektion), die ein Fehlen von Immunität Mängel in dem Kind angegeben. Sonstige Krankheiten des befragten Kindes nicht offenbart. In diesem Fall hat es Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der SCC Verwendung des beanspruchten Verfahrens und den Prototyp-Bestimmungsverfahren, wobei die Ergebnisse die SCC korrelierte mit den klinischen Daten zu bestimmen.

Beispiel 2.

Natalia K., 16 Jahre alt. Adressiert an der Kinderklinik an der Kinderklinik No.1 mit Beschwerden über häufige Erkältungen (SARS 1-2 mal im Monat), die in den letzten 6 Jahren beobachtet wurden. Krankheiten in einigen Fällen (für die stationäre Behandlung von Patienten in Krankenhäusern für schwere akute respiratorische Virusinfektionen, Bronchitis) bestätigt virologische Forschungsmethoden (Immunofluoreszenz Studie von Abstrichen aus der Schleimhaut der Nase und Rachen, die Untersuchung von gepaarte Seren auf Antikörper gegen den respiratorischen Viren). In der Studie der Immunstatus des Patienten Anzahl von T und B-Lymphozyten, der Gehalt an Immunglobulinen (IgA, IgM, IgG) entsprach den normalen alters Indikatoren.

Der Patient gehalten SCC Bestimmung des erfindungsgemässen Verfahrens und der Prototyp-Verfahren in Beispiel 1 beschrieben ist.

In den SCC Bestimmung des erfindungsgemässen Verfahrens in jeder Versuchszentrifugenröhrchen unter Verwendung von 31 & mgr; l Suspension von mononuklearen Zellen und 25 & mgr; l Suspension von Ratten-Mastzellen hinzugefügt wurde (Verhältnis von mononukleären Zellen und Mastzellen in der Ratte Versuchsproben bis 25 entsprach: 1). In jedem Steuer wurde Zentrifugenröhrchen 25 & mgr; l und 31 & mgr; l Ratten-Mastzellsuspensionsmedium 199. Die Bestimmungsergebnisse addiert werden in Tabelle gezeigt. B.

Degranulation% I = 12%

II% Degranulation = 13%

III% Degranulation = 12%

% Degranulation Mi = 12,3%

Die sich ergebende Mittelwert des SCC (12,3%) war es möglich, bei den untersuchten Patienten, dass die reduzierte (im Vergleich zur Norm) SCC abzuschließen. Bei der Bestimmung nahm das Verfahren 2 Stunden und 30 Minuten (2,5 Stunden).

Die Ergebnisse des RCC den Prototyp-Methode: die durchschnittliche (von 3 Proben) SCC-Wert (% Lyse) betrug 58,1%, die der Feststellung bei einem Patienten mit SCC im normalen Bereich anzeigt. Bestimmungsverfahren dauerte 88 Stunden 15 Minuten (88,3 Stunden).

Wenn für 14 Monate, einen Patienten in dynamics Überwachung trotz Behandlung (IRS-19, ribomunil) blieb die Frequenz von SARS relativ hoch (1 alle 1-2 Monate), obwohl sie vor der Behandlung im Vergleich mit der Frequenz von SARS beobachtet sank .

So führt die Ergebnisse der klinischen Untersuchung des Patienten und Beobachtung der Dynamik zu dem Schluss, dass in diesem Fall gibt es eine reduzierte antivirale Widerstand, der durch die Aktivität von Zellen verursacht wird, um die SCC besitzen. Dies bestätigt die Ergebnisse der Bestimmung durch das beanspruchte Verfahren erhalten werden, und bot die Möglichkeit, die Ergebnisse der Bestimmung durch das Verfahren des SCC-ähnlichen Prototyp lozhnozavyshennye zu interpretieren.

Beispiel 3.

Sasha K., 3 Jahre. Er trat in den Brenneinheit DGB 1 mit einer Diagnose von thermischen Verbrennungen Oberschenkel, Unterschenkel, S = 25%, IIA-III Grad.

Der Patient wurde Haut eines menschlichen Embryos verpflanzt. Ab 2 Tage nach der Hauttransplantation Operation, durchgeführt Ablehnung tägliche Überwachung Transplantation des beanspruchten Verfahrens unter Verwendung von und den Prototyp Verfahren in Beispiel 1 beschrieben.

In den SCC Bestimmung des erfindungsgemässen Verfahrens in jeder Versuchszentrifugenröhrchen unter Verwendung von 38 & mgr; l Suspension von mononuklearen Zellen und 25 & mgr; l Suspension von Ratten-Mastzellen hinzugefügt wurde (Verhältnis von mononukleären Zellen und Mastzellen in der Ratte Versuchsproben bis 30 entsprach: 1). In jeder Kontrolle wurde Zentrifugenröhrchen 25 & mgr; l Suspension von Rattenmastzellen und 38 & mgr; l 199-Medium zugegeben.

Bestimmungsergebnisse sind in der Tabelle gezeigt. V.

Sich die Zeit nehmen, das Verfahren für die Verwendung des beanspruchten Verfahrens und der Prototyp-Methode, um zu bestimmen, es belief sich auf jeweils 2 Stunden 10 Minuten (2,2 Stunden) und 89 Stunden 30 Minuten (89,5 Stunden).

Am 10. Tag nach wurde die Operation klinisch Krise der Transplantatabstoßung registriert - embryonale Haut transplantiert. Somit wird das beanspruchte Verfahren die Wahrscheinlichkeit einer Krise vorherzusagen, weil ab dem 7. Tag nach der Operation eine Erhöhung SCC-Werte im Vergleich zu normalen SCC war. HPCC, vom Prototyp-Verfahren bestimmt, während des gesamten Beobachtungszeitraum schwankte leicht, ohne den Bereich der normalen SCC-Werte geht, so dass die Ergebnisse als zytotoxische Antwort lozhnozanizhennye zu betrachten. Vorhersage der Wahrscheinlichkeit einer Krise der Transplantatabstoßung nach der Methode des Prototyps war nicht möglich.

Mit dem beanspruchten Verfahren wurde in vitro 286 Kinder im Alter von 3 bis 16 Jahren untersucht. Zur gleichen Zeit in der Umfrage 274 Kinder beanspruchte Verfahren wurde im Rahmen eines Screening-Programm zur Identifizierung immunologischen Prädisposition für häufige Infektionen der Atemwege (Gruppe A) verwendet. Darüber hinaus wurde das beanspruchte Verfahren verwendet 12 Patienten mit Verbrennungen (Gruppe B) zum Zweck Umfrage der Überwachung der Umsetzung von Transplantatabstoßung (transplantierten Hauttransplantation). Die Untersuchungen wurden auf der Grundlage des City Hospital 1 St. Petersburg Kinder durchgeführt (Kinderklinik an der Kinderklinik Nr.1, brennt Einheit 36 ​​DGB 1), und auf der Grundlage von Kinder polyclinic 60 (St. Petersburg) und die regionalen Kinderklinik. Die Kriterien für die Wirksamkeit der SCC Bestimmung der beanspruchten Verfahren als die Genauigkeit der Bestimmung (Anzahl der bestätigten Ergebnisse der Definition) diente Verwendung, sowie die Festlegung von Verfahren und Dauer (als Ergebnis des Timings der Erfinder). Um das Vorhandensein oder Fehlen von Anomalität SCC Werten durchgeführt Anamnese, die Beurteilung der klinischen Erkrankung, klinische und instrumentellen und klinischen und Laborüberwachung von Patienten in der Dynamik bestätigen.

Diese Kinder wurden parallel mit dem Prototyp-Methode [4] untersucht. Wirkungsgrad Bestimmung von SCC wurde unter Verwendung der gleichen Kriterien wie in dem Fall des beanspruchten Verfahrens bewertet.

Die statistische Analyse wurde durch die Berechnung der genauen Bedeutung der Unterschiede teilen sich die Methode j (Ecke Fisher - Transformation) durchgeführt [8].

Die Daten in Tabelle 4, dass das erfindungsgemässe Verfahren eine klinisch bewährte Ergebnisse vorgesehen ist SCC zu erhalten, in 100% der Fälle zu bestimmen und in der Abwesenheit von lozhnozanizhennyh lozhnozavyshennyh Bestimmungsergebnisse. In der Gruppe A reduziert SCC in 82 Kinder registriert wurde (29,9%). Alle diese Kinder, oder (in der Regel) eine Geschichte von häufigen haben (8-10 mal pro Jahr), akute Infektionen der Atemwege / ARI / (SARS, Bronchitis, Lungenentzündung), die durch klinische, klinische und instrumentelle, klinische und virologische Laboruntersuchungsmethoden bestätigt, oder wenn in der Dynamik einer starken Zunahme der Inzidenz von ARI (bis zu 8-10 mal pro Jahr) im Vergleich zu der Zeit vor der immunologische Untersuchung betrachtet. Normale SCC bei 191 Kind in der Gruppe A registriert (69,7%) und wurde durch die Ergebnisse der klinischen Untersuchung und Beobachtung in der Dynamik bestätigt (Häufigkeit von ARI 1-2 mal pro Jahr, das Fehlen von anderen Krankheiten). Der erhöhte Wert der SCC in der Gruppe A bei 1 Patienten erhalten wurde, nicht als lozhnozavyshennoe, t gesehen. To. Bei diesem Patienten Wurmbefall (ascariasis) bei der klinischen Untersuchung festgestellt wurde. Es wird angenommen, dass die Zellen in SCC beteiligt und kann in den Schutz von Helminthen, die zu einer erhöhten Aktivität führt von zytotoxischen Zellen teilnehmen.

In der Gruppe B erhöht SCC bei 7 Patienten (58,3%) für die Zeit nach der Transplantation 7-8 Tagen gefunden. Alle diese Patienten (100% der Zeit) am Tag 10-14 nach der Transplantation war klinisch Mitglied Krise Hauttransplantatabstoßung transplantiert. Bei 3 Patienten mit einem transplantierten Hauttransplantation wurde normale SCC beobachtet; bei 2 Patienten der Gruppe B - SCC reduziert. Keiner dieser Patienten beobachtet, wenn die Dynamik wurden Transplantatabstoßungskrisen aufgezeichnet. Zur gleichen Zeit in beiden Patienten mit eingeschränkter SCC Geschichte, häufige akute respiratorische virale Infektion (8 und 9-mal pro Jahr), bestätigt durch die klinische, klinisch und instrumental, klinischen und virologischen Laboruntersuchungsmethoden.

Aus Tabelle 4 ist es klar, und das erhaltene des Prototyps Verfahren zur Bestimmung der SCC verwendet wurden nur 65,0% der Fälle klinisch bestätigt; in 28,3% der Fälle durch die SCC-Werte empfangen wurden als lozhnozanizhennye, und in 6,7% der Fälle betrachtet - als Ergebnis lozhnozavyshennye Definition (p <0,001 im Vergleich mit den entsprechenden Werten von Parametern des beanspruchten Verfahrens). In der Gruppe A reduziert SCC stellte in 145 Patienten (52,9%) wurde klinisch bestätigt (ähnlich dem beanspruchten Verfahren), in nur 68 Patienten (24,8%) (die Häufigkeit von ARI 8-10 mal pro Jahr). Eingetragen in 77 Kindern (28,1%) verringerte Leistung SCC wurden als lozhnozanizhennye angesehen, dass sie nicht von einer Krankengeschichte oder unter der Aufsicht der Dynamik (Häufigkeit der ARI 1-2 mal pro Jahr bestätigt wurden .. Das Fehlen von anderen Krankheiten, wie Tumoren , Leukämie, etc., die die niedrigen SCC-Werte) bestimmen konnten.

Normalwerte SCC in 116 Kinder identifiziert (42,3%) wurden klinisch bestätigt (ähnlich dem beanspruchten Verfahren) nur 110 Kindern (40,1%). In 5 Kindern (1,8%) von 116 dieser Ergebnisse die lozhnozavyshennye zu bestimmen, wurden in Betracht gezogen, weil haben eine Geschichte von häufigen akuten Atemwegsinfektionen (8-10 mal pro Jahr) und ein Kind (0,4%) registriert hat eine normale SCC als lozhnozanizhennaya auf das Vorhandensein von helminthic Invasion aufgrund gefeiert, die kann, wie oben erwähnt, die erhöhte Aktivität von zytotoxischen zu bestimmen Zellen. In 13 Kinder (4,8%) erhöhte SCC wurde ausgezeichnet, der als lozhnozavyshennaya gefeiert wurde, weil 4 Kinder (1,5%) waren fast gesund und 9 Kinder (3,3%) hatte eine Geschichte von häufigen Atemwegsinfektionen (ARI Frequenz von mehr als 8 Mal pro Jahr).

In der Gruppe B erhöht wurde SCC mit dem Prototyp-Verfahren bestimmt nur 4 von 7 Patienten mit einer klinischen Abstoßungsreaktion Krise aufgenommen wurde. Bei 3 Patienten mit einer Krise der Abstoßung der transplantierten Hautlappen Normalwerte wurden SCC erhalten, wie lozhnozanizhennye angesehen. Von den 5 Patienten mit transplantierten Hauttransplantation ohne Ablehnung letzte Patient beobachtet Rückgänge im SCC, die mit klinischen Daten (Häufigkeit von SARS - 9 Krankheiten, für die vorhergehende verbrennt ein Jahr) korreliert und bei 4 Patienten Werte erhielten, waren SCC innerhalb der normalen Grenzen . Zur gleichen Zeit bei 3 Patienten (aus diesen 4 Patienten) hatten normale Werte des SCC bestätigt klinisch, und ein Baby Ergebnisse wurden als lozhnozavyshennye betrachtet (in der Geschichte - die Häufigkeit von SARS 8 mal pro Jahr).

Die Daten in Tabelle 4 und zeigen, dass die Dauer des Verfahrens für den SCC Bestimmung des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung von 2-2,5 Stunden wurde, während bei der Verwendung der Prototyp-Methode ähnlich Figur 88-90 Stunden.

Somit liefert das erfindungsgemäße Verfahren in seiner Durchführung Genauigkeit erhöht in der SCC Bestimmung im Vergleich zu der Prototyp-Methode: die Anzahl der Bestimmungsergebnisse korrelieren mit denen der klinischen Untersuchung, erhöht sich um 35%, in Abwesenheit lozhnozanizhennyh und lozhnozavyshennyh Bestimmungsergebnissen (im Gegensatz zum Prototyp-Verfahren, wo lozhnozanizhennye lozhnozavyshennye und die Ergebnisse sind jeweils 28,3 und 6,7%). Die Dauer Bestimmungsverfahren des beanspruchten Verfahrens unter Verwendung von 35-45 mal (im Vergleich mit dem Prototyp-Methode) reduziert. Außerdem, mit Ausnahme der Vorgehensanalyse im Zusammenhang mit Markierungsmaterialien mit einem Radioisotop, beseitigt es die Notwendigkeit einer speziell ausgerüsteten Labors und geschultes Personal, das die Art und Weise vereinfacht.

QUELLEN VON INFORMATIONEN

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FORDERUNGEN

1. Verfahren zur Bestimmung der spontanen Zell-Cytotoxizität, bestehend aus einem Patienten, aus dem peripheren Blut mononukleäre Zellen zu isolieren, die Vorbereitung der Zielzellen, mononukleären Zellen und das Mischen der Zielzellen, und die Mischung aus mononukleären Zellen von Zielzellen durch Licht der cytotoxischen Antwort gefolgt Inkubieren, dadurch gekennzeichnet, daß die kletok- 1, unmittelbar nach dem Mischen von mononukleären Zellen und Ratten-Mastzellen weiter zentrifugiert erhaltene Gemisch, und Inkubieren des Gemischs aus mononukleären Zellen von Ratten-Mastzellen erzeugen innerhalb von 30 Minuten und zeichnet die Ergebnisse der zytotoxischen: target unter Verwendung von Rattenmastzellen werden in einem Verhältnis von 20-30 Mastzellen und mononukleären Zellen von Ratten gemischt die Reaktion wird durch Zählen der Anzahl der degranulierten Mastzellen von Ratten als Prozentsatz der Gesamtzahl der Ratten-Mastzellen und mononukleären Zellen in einer Mischung aus Mastzellen und Ratte bei einem Wert des Index von weniger als 25%, bestimmt durch eine verringerte spontane zelluläre Zytotoxizität, wenn der Indexwert bestimmt wird, durchgeführt 25-35% normalen spontanen zelluläre Zytotoxizität, und ein Wert des Index von mehr als 35% durch eine erhöhte spontane zelluläre Zytotoxizität bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dass während des Registrierungsergebnisse cytotoxischen Antwort gekennzeichnet, unmittelbar bevor die Anzahl der degranulierten Mastzellen von Ratten in einer Mischung von einkernigen Zellen und Ratten-Mastzellpellet Herstellung und Rühren der Mischung des Überstands von mononukleären Zellen und Mastzellen von Ratten zu zählen.

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Erscheinungsdatum 02.04.2007gg