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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2251701

Verfahren zur Diagnose einer HIV-Infektion

Verfahren zur Diagnose einer HIV-Infektion

Name des Erfinders: Sizyakina Ljudmila Petrovna (RU); Irina Iwanowna Andreeva (RU)
Der Name des Patentinhabers: Sizyakina Ljudmila Petrovna (RU); Irina Iwanowna Andreeva (RU)
Korrespondenzanschrift: 344022, Rostov-on-Don, trans. Nachitschewan, 29, Rostov State Medical University, Department of Patent
Startdatum des Patents: 2004.06.07

Die Erfindung betrifft das Gebiet der klinischen Immunologie und kann verwendet werden, die Phase der HIV-Infektion zu bestimmen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß durch Enzym-Immunoassay-Testserum, die optische Dichte - OP ursprünglichen Serumprobe und der Extinktion anfänglichen Serumprobe, mit 100 für 10 Minuten inkubiert ul 3,5 M Lösung von Natrium-Isothiocyanat - NaSCN und bei niedrigeren OD 40% oder weniger diagnostiziert Schritt a - generalisierte Lymphadenopathie, mit einer Abnahme der OD im Bereich von 40-60% in Schritt diagnostiziert wird - pre-AIDS und bei der Reduzierung von 60% OP zu diagnostizieren und zu Stufe mehr C - AIDS.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, vorzugsweise Clinical Immunology, nämlich Immun Infektion durch Human Immunodeficiency Virus (HIV) und kann bei der Bestimmung der Phase der HIV-Infektion verwendet werden.

HIV-Infektion weiterhin eine der tatsächlichen Probleme der modernen Medizin. Seit 1990 registriert es eine Pandemie, die die Ausbreitung der Krankheit auf der ganzen Welt bedeutet, während in Russland gibt es mehr als 200.000 Menschen mit HIV in den letzten 3 Jahren lebt. Verteilt auf die "neuen" Bereichen, wird die Krankheit nicht weggehen von früheren gefangen. Darüber hinaus ist die Biologie der HIV-Infektion, dass es keine natürliche Mechanismen der Konfrontation sind, und nur soziale Faktoren weiteren Verlauf der Pandemie entgegenwirken kann (PMHaitov, G.A.Ignateva, I.G.Sidorovich Immunologie - M:.. Medizin, 2000. - Mit 0,291-295).

Für wirklich wirksame Möglichkeiten, die Ausbreitung von HIV zu bekämpfen sollten zeitnah und qualitative Diagnose umfassen, kann die Bedeutung von denen zwei Positionen zurückgeführt werden. Erstens Identifizierung der Infektion Tatsache ermöglicht die Verwendung von wirksamen Methoden der weiteren Ausbreitung der Infektion verhindert wird. Zweitens trägt die frühe Diagnose einer Infektion mit HIV auf die rechtzeitige Bestellung von ausreichend wirksamen therapeutischen Interventionen, die die ersten Stadien der HIV-Infektion zu verlängern und damit erheblich seine Progression beeinflussen. In dieser Hinsicht ist ein sehr aktuelles Thema bleibt die Auswahl zuverlässiger Kriterien sein, schnell, zuverlässig, pünktlich und mit minimalem Materialkosten das Stadium der Infektion mit HIV (L.P.Sizyakina, V.N.Chernyshev verursacht zu bestimmen - HIV-Infektion bei Kindern. - Rostov-on-Don - 2001 - S.81).

WHO derzeit Klassifizierung der Phasen des Infektionsprozesses vermittelt durch HIV angenommen, basierend auf klinischen Manifestationen, unter denen die anfängliche oder Stufe A bestimmen - generalisierte Lymphadenopathie (GLAP), die nicht nur durch die Abwesenheit von pathognomonische Zeichen gekennzeichnet ist, aber klinisch stabilen Zustand des Patienten. bazillären Angiomatose, oropharyngealen Candidosen, Zervixkarzinom, obscheinfektsionnye Syndromen, wie Fieber oder Durchfall über einen Monat, Leukoplakie Sprache, idiopathische thrombozytopenische Purpura, peripherer Neuropathie - Schritt B (pre-AIDS) wird durch die Zunahme verschiedener klinisch relevanten Symptome gekennzeichnet. Für die Stufe C - AIDS (Terminal) charakteristische klinische Symptome sind Lungentuberkulose, rezidivierende Pneumonie, Tumoren verschiedener Lokalisation (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, R.22). Die Definition eines infektiösen Prozessschritte notwendig, rechtzeitige Therapieoption zu unterstützen, die durchschnittliche Dauer des Lebens von Menschen, die mit HIV leben und zu verhindern, dass die Ausbreitung der Infektion zu verlängern können. Die Analyse des Patents, wissenschaftliche und medizinische Literatur ist eine Reihe von Möglichkeiten identifiziert HIV-Infektion zu diagnostizieren.

Insbesondere verwendet der Test das Stadium der HIV-Infektion und sind die Grundlage für die Ernennung der antiviralen Therapie zu bestimmen, peripheren Blut-Viruslast durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Kravchenko AV, Serebrovskaya LV, EL Golohvostova zu bewerten usw. Timazid in Kombination mit Invirase hividom und in voller Bearbeitung oder Behandlung von Patienten mit HIV-ifektsii - .. Epidemiologie und Infektionskrankheiten -. 1998. - №5 - s.51-52). Das Wesen des Verfahrens besteht in der quantitativen Bestimmung der Kopien der viralen RNA im Plasma. Es sollte jedoch das Fehlen einer klaren Korrelation zwischen dem Fortschreiten der Infektion und eine Viruslast des Plasmas bemerkt werden. Insbesondere entspricht Schritt A von HIV-Infektion hohe Niveaus an Virus im Plasma. Die nächste Stufe - das (pre-AIDS) wird durch eine wesentliche Reduzierung der Anzahl der Kopien der viralen RNA trotz der klinischen Progression der Infektion aus. In Endstadium C (AIDS) re-registriert unbegrenzte Progression der HIV-RNA-Spiegel im Blut (V.V.Shkarin, S.N.Sorinson HIV / AIDS - Infektion Zwanzig Jahre nach dem Beginn einer Pandemie - N. Novgorod: ... Izd in NSMA 1999 - S.43). Somit ist dieser Test nicht ausreichend informativ das Niveau der Entwicklungs immunodeficiency zu charakterisieren. Die Nachteile des Verfahrens sollte auch die hohen Kosten und technologische Komplexität, nämlich: die Notwendigkeit einer strikten Einhaltung der besonderen Bedingungen - Temperatur und Sterilität bei der Blutentnahme, den Transport und die Durchführung der Prüfung. So zusätzlich zu diagnostischen Kits zertifiziert notwendig, nicht nur sehr teure Ausrüstung, sondern auch komplexe Laborräume, einschließlich sterile Boxen. Das direkte Verfahren das Virusgenom eher mühsam und langwierig zu bestimmen, dauert mindestens 5 Stunden.

Das Verfahren der Labordiagnose der HIV-Infektion (Patent №2123187 in №34 BI veröffentlicht) liefert Ionenchromatographie durch Serum-ELISA-Bestimmung des Niveaus von "hidden" Antikörper gefolgt auszutauschen. Dieses Verfahren, das einen Wert in der Prognose von HIV-Infektion hat, ist nicht auf die Definition der einzelnen Phasen konzentriert.

Ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das humane Immundefizienzvirus (US-Patent. №2032907 veröffentlicht in BI №10) können bei der Bestimmung, ob der HIV-Infektion verwendet werden, aber nicht im Zusammenhang mit der Definition Stadium der Infektion zu bestimmen.

Methode ELISA Nachweis von Antikörpern gegen Human Immunodeficiency Virus (US-Patent. 4.653.296 / 30-13, №45 BI) zielt darauf ab, die Empfindlichkeit des Verfahrens Nachweis von Antikörpern gegen HIV zu erhöhen, aber auch nicht verwendet werden können, auf die Bühne des Infektionsprozesses zu diagnostizieren.

Bekannte Verfahren zur Abschätzung einer HIV-Infektion (Klinische Immunologie und Allergologie ed G.Lolora Jr. - .. M., Praxis, 2000. - P. 585-587), die bei der Bestimmung der Serumspiegel besteht 2-Mikroglobulin. unter Verwendung eines Enzym-Immunoassays bestimmt die Proteinkonzentration zunehmende Diagnosekits zur Progression von HIV-Infektion entspricht. Unterdessen sind diese Veränderungen nicht-spezifische, wie der Sprecher 2-Mikroglobulin kann nur mit HIV, sondern auch in Tumorprozesse, Leberzirrhose, lymphoproliferative Erkrankungen gemacht werden. Somit ist dieses Verfahren nicht ausreichend informativ die Phasen der HIV-Infektion zu beurteilen aufgrund ihrer unspezifischen (A.Royt, J. Immunology Bristoff - ... M: Mir, 2000. - p.411).

Die nächste technische Lösung, die uns als Prototyp angenommen, ist ein Verfahren zur Diagnose einer HIV-Infektion (VV Pokrowski et al "Klinische Diagnostik und Therapie der HIV-Infektion." - M:.. SEI VUNMTS der Russischen Föderation, 2001 - S.11 ), die bei der Bestimmung der absoluten Zahl der CD4 + Lymphozyten aus peripherem Blut besteht. Dieses Verfahren besteht aus mehreren aufeinanderfolgenden Stufen: population Trennung Lymphozyt durch Schichtung 2 ml Blut hergestellt vorher Ficoll - Lösung und verografin abgestufter Dichte 1,077 g / cm 3, für die sich ergebende Mischung in eine Zentrifuge OPN-3 mit einer Rate von tausend Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. 35 Minuten das gebildete Rohr an einem separaten "ring lymphatischer", gefolgt von drei mal "Waschen" aus einer Mischung aus Ficoll Entfernen - verografin das Kulturmedium für 5 Minuten bei 1,5 199.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert .. Weiter zu der Suspension von gewaschenen Lymphozyten monoklonalen Antikörpern CD4-Oberflächenantigen mit einem Fluorochrom markiert hinzugefügt wurden, wurde die Suspension 40 Minuten bei 4ºC inkubiert, dann gewaschen, erneut durch Zentrifugation OPN-3-Medium 199 für 5 Minuten bei 1500 Umdrehungen pro Minute. Dies wird durch die Bestimmung der relativen Mengen von CD4-positiven Lymphozyten mittels Durchflusscytometrie gefolgt. Dass dieses Gerät erlaubt den am besten geeigneten Ebene der CD4 + Zellen Auswertung. Am selben Tag, die Formel Blut des Patienten zu bestimmen und dann die absolute Zahl der CD4 + lifotsitov nach folgender Formel berechnet: Die Anzahl der weißen Blutkörperchen 10. September × L × × %% Lymphozyten CD4 + limfotsitov: 10000. Hier wird , wenn die absolute Zahl der CD4 + T - Zellen über 0,5 × 10 9 / l, mit der Stufe A diagnostiziert; bei der absoluten Menge an CD4 + lifotsitov innerhalb 0,2-0,499 × 10 9 / L - die Bühne; bei der absoluten Zahl der CD4 + Lymphozytenzellen weniger als 0,2 × 10 9 / L mit der Stufe C diagnostiziert - (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, R.22). Der Nachteil des Verfahrens - die Komplexität der Implementierung. Insbesondere können die Ergebnisse dieses Tests nur Ziel sein, hochspezifische Reagenzien zertifiziert mit (monoklonale Antikörper), und das Gerät ist extrem teuer - Durchflusszytometrie erfordern Hilfskräfte - Ingenieure, Programmierer. Diese Diagnose-Tools sind nur in spezialisierten Zentren auf regionaler Ebene, die die Fähigkeit stark erschwert die Stadien der HIV-Infektion zu bewerten. In erster Linie aufgrund der Tatsache, dass die Analyse auf die Eigenschaften der lebenden Blutzellen Rezeptoren basiert, so dass die Untersuchung auf den Zeitrahmen begrenzt ist - das Intervall zwischen Blutentnahme und Testen nicht 3-4 Stunden nicht überschreiten sollte. Methodik komplizieren und zusätzliche Tests - Blutformel und die Gesamtzahl der weißen Blutzellen zum Zwecke der Berechnung der Hauptkriterien - die absolute Anzahl der CD4 + Lymphozyten aus peripherem Blut. Für den Prototyp aufgrund der Labilität der Indikatoren durch ungenügende Aussagekraft gekennzeichnet ist nicht direkt mit der Tatsache der HIV-Infektion verwandt. Veränderungen in der Anzahl von CD4 + -Lymphozyten ist sehr unspezifisch und bei anderen Erkrankungen auftreten. In dieser Hinsicht kann der diagnostische Wert des Tests nur wichtig sein, in Zusammenhang mit anderen Kriterien für die HIV-Infektion.

Die vorliegende Erfindung ist das Verfahren zur Diagnose von HIV-Infektion zu vereinfachen.

Diese Aufgabe wird durch die Untersuchung des Patienten Blutserum erreicht, die in zwei Teile geteilt wurde. Auf der Basis von Immunoassay wird die optische Dichte (OD) der ursprünglichen Serumprobe, das Niveau der spezifischen anti-HIV-Antikörper in einem Patienten zu reflektieren und einen zweiten Abschnitt OP für 10 min mit 100 ul 3,5 M Natrium Isothiocyanat inkubiert und Charakterisieren der Ebene der Anti-HIV Immunglobuline, nicht brechen die Verbindung mit dem Antigen-ELISA-Platte unter den Bedingungen der Inkubation mit NaSCN. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen% Reduktion der OD-Werte durch den anfänglichen Schritt des Serum HIV-Infektion bestimmt: OD-Abnahme um 40% oder weniger Schritt A diagnostiziert - generalisierte Lymphadenopathie, optische Dichte im Bereich von 40-60% offenen diagnostiziert Stufe B abnehmend - pre-AIDS und mit einer Abnahme der OD von 60% oder mehr diagnostiziert Stufe C - AIDS.

Das vorgeschlagene Verfahren wird wie folgt implementiert: die venöse Blutentnahme des Patienten wird in einer Menge von 3,2 ml durchgeführt, wonach sie für 10 Minuten in einer Zentrifuge OPN-3 Serum bei dreitausend Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wurde, wurde abgetrennt, teilen ihn in zwei Teile .. Serumprobe in die Vertiefung der ELISA-diagnostischen Testsystemen mit adsorbierten Antigenen von HIV (in Übereinstimmung mit der Verordnung des Ministeriums für Gesundheit und MP der Russischen Föderation №170 von 08.16.94) zugegeben. Dann wird die Lösung Serumkomponenten zu entfernen, gewaschen, die nicht mit HIV-Antigene in Beziehung stehen. Ferner wurde die auch anti-human an ein Enzym konjugiertes Immunglobulin zugegeben, die Farbe nacheinander zugegeben chemischen Reagens ändert - Substrat. Im Fall des Testserums in anti-HIV-Antikörpergehalt ändert sich die Farbe Vertiefungen. Mit einer speziellen Vorrichtung - Automatische Enzym-Immunoassay-Analysators um die optische Dichte des Inhalts der Vertiefungen bestimmen, die den Gehalt an spezifischen Antikörpern gegen HIV in der Probe widerspiegelt.

Gleichzeitig wurde die zweite Well-Platte zusätzlich zu den Diagnosetestserum zugegeben 100 ul von 3,5 M Lösung von Natrium-Isothiocyanat (NaSCN) wurde die resultierende Lösung für 10 min inkubiert. Dann beobachtet die Abfolge der oben beschriebenen Schritte: gewaschenen Lösung Serumkomponenten zu entfernen, die nicht mit HIV-Antigenen in der Vertiefung verbunden sind, um die Antikörper gegen Human-Immunglobuline, konjugiert an ein Enzym zugesetzt, die farbsequentiellen Zugabe eines chemischen Reagenz ändert - Substrat in Gegenwart von Testserum Anti -VICH Antikörper Inhalt der Wells wird die Farbe ändern. Verwendung von Enzym-Immunoassay-Analysegerät automatisch die optische Dichte des Inhalts der Vertiefungen bestimmen, die den Gehalt an spezifischen Antikörpern gegen HIV nach der Behandlung mit 3,5 M Natrium-Isothiocyanat (NaSCN) widerspiegelt.

Als nächstes berechnen OD% Veränderung gegenüber dem Ausgangsserumprobe und die Verringerung der OD-Werte von 40% oder weniger der Stufe A diagnostiziert - generalisierte Lymphadenopathie, mit einer Abnahme der OD offenen Intervall 40-60% in Schritt diagnostiziert - Pre-AIDS und OD bei der Verringerung der 60% oder mehr sind mit der Stufe C diagnostiziert - AIDS.

Implementiertes Verfahren durch die folgenden klinischen Beispiele unterstützt.

Beispiel 1. Der Patient S., Anamnese №122 / 198. Während der epidemiologischen Untersuchung wurde als Kontakt mit infizierten HIV identifiziert. Die klinische Untersuchung ergab keine Anzeichen für Pathologie. Beschwerden waren nicht zufriedenstellenden Zustand. Der Patient nach der Untersuchung von Blutserum wurde auf dem vorgeschlagenen Verfahren durchgeführt, die in den folgenden Ergebnissen führte: ref = OP 1500 OP Inc. = 1200. Im Zusammenhang mit der Reduktion von 20% OP Stufe A diagnostizierten HIV-Infektion.

Beispiel 2 Patient D., Anamnese 68/103. Wenn die geplante dispensary Prüfung wurde generalisierter Lymphadenopathie ergab, gepatospleiomegaliya. Der Patient, in Übereinstimmung mit dem beanspruchten Verfahren ein Blutserumtest durchgeführt wurde. Der OD-Wert ref = 1627 = 897 OD Inc., verringert OD = 45%, in Verbindung mit dem ein Patient mit HIV-Infektion in dem Stadium diagnostiziert - pre-AIDS, adäquate Therapie.

Beispiel 3 Patient E., Anamnese 1203/109. Ich war in einem Krankenhaus für Infektionskrankheiten mit klinischen Manifestationen von PCP und Nephropathie. Der Patient, in Übereinstimmung mit dem beanspruchten Verfahren ein Blutserumtest durchgeführt wurde. Ref = OP 1020 OP = 340 Inc., eine Abnahme der optischen Dichte = 67%. Der Patient, in Übereinstimmung mit dem beanspruchten Verfahren mit "AIDS", adäquate Therapie diagnostiziert.

Beispiel 4. Patient S., Anamnese 101/04. Im Laufe des Jahres war es in der Apotheke im regionalen Zentrum für die Prävention und Bekämpfung von AIDS, hatten keine Beschwerden. Gemäß dem beanspruchten Verfahren wurde ein Blutserumtest durchgeführt. Der OD-Wert ref = 1920 = OP Inc. im Jahre 1152, was einem Rückgang OD = 40% und damit mit einer HIV-Infektion diagnostiziert, Schritt A - generalisierte Lymphadenopathie.

Beispiel 5: Patient S., Krankengeschichte 88/98. Identifiziert als Kontakt mit HIV infiktsirovannymi intravenösen Drogenkonsumenten. Bei der klinischen Untersuchung wurde eine Lungenentzündung ergab, festgestellt, dass Reduzierung des Körpergewichts von 16 kg in sechs Monaten. Der Patient, in Übereinstimmung mit dem beanspruchten Verfahren ein Blutserumtest durchgeführt wurde. Der OD-Wert ref = 1950 = 780 OD Inc., verringert OD-Werte = 60%. Der Patient hatte diagnostiziert worden - HIV, Schritt - "AIDS", adäquate Therapie.

In Übereinstimmung mit dem vorgeschlagenen Weg, die HIV-Infektion des Schätzens von uns auf Basis NUPK "Clinical Immunology" RostGMU 86 Serumproben von infizierten Patienten wurden getestet. Von diesen 44 mit HIV-Infektion in Schritt A als niedrigere OD Werte diagnostiziert betrug 40% oder weniger, 32 Patienten - diagnostiziert HIV in Schritt B - pre-AIDS (OP verringerte sich um mehr als 40, jedoch weniger als als 60%) und 10 als Stufe C (AIDS) diagnostiziert Personen war die% Reduktion der OD 60 oder mehr.

Unsere Analyse von 42 Fallgeschichten von Personen, die in einer spezialisierten Einheit von HIV-1 GB Rostov-on-Don, davon im Krankenhaus sind, hatten 20 eine Diagnose "HIV-Infektion in der Stufe A (GLAP)", statt in 16 - "HIV in Schritt B (pre-AIDS)", und bei 6 - "AIDS". kontaktieren wurden diese Patienten untersucht nach dem beanspruchten Verfahren. Die Ergebnisse zeigten, dass die drei Personen aus 20 diagnostiziert "HIV in der Stufe A" wurde diese Patienten fälschlicherweise Kontakt hergestellt wurden mit der Stufe B diagnostiziert - Pre-AIDS (OP verringerte sich um mehr als 40, aber weniger als 60 %), die anschließend durch klinische Zeichen bestätigt, vier Patienten von 16 mit einer Diagnosephase B (pre-AIDS) us auf der Grundlage der beanspruchten Methode wurde HIV-Infektion die Diagnose die Diagnose "AIDS" bestimmt, als% Abnahme der OD = 60 oder mehr. Dies ermöglichte es anpassen rechtzeitig die Therapie. In 100% der Fälle von Endstadium einer HIV-Infektion (AIDS) diagnostiziert übereinstimmen (alle Patienten verringern in OD gleich oder größer als 60%). Darüber hinaus ist für die Diagnose der HIV-Infektion Stufen gemäß dem beanspruchten Verfahren erfordert nicht die Verwendung von zusätzlichen Arbeitskosten, diagnostische Kits und teure Ausrüstung.

Somit ist das vorgeschlagene Verfahren im Vergleich zum Stand der Technik einfacher.

FORDERUNGEN

Verfahren zur Diagnose einer HIV-Infektion durch Blutuntersuchungen, dadurch gekennzeichnet, dass das Blutserum durch Enzymimmunoassay getestet wird, wird die optische Dichte - OP ursprünglichen Serumprobe und der Extinktion anfänglichen Serumprobe, für 10 min mit 100 ul 3,5 M-Lösung inkubiert Isothiocyanat Natrium - NaSCN und OP, während mindestens 40% zu reduzieren und zu diagnostizieren, die Phase a - generalisierte Lymphadenopathie, mit einer Abnahme der OD 40-60% Bereich wird in Schritt diagnostiziert - pre-AIDS und 60% OP bei der Verringerung mehr C zu diagnostizieren und stage - AIDS .

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Erscheinungsdatum 06.01.2007gg