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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2080598

VERFAHREN ZUR ERMITTLUNG aktivierten T-Lymphozyten im menschlichen Organismus

VERFAHREN ZUR ERMITTLUNG aktivierten T-Lymphozyten im menschlichen Organismus

Name des Erfinders: Frolov Alexander K. [UA]; Shipityak G. Eustace [UA]; Negustorova Alla Fedorovna [UA]; Lupinos Oksana Vitalevna [UA]; Piskun Marina Nikolajewna [UA]
Der Name des Patentinhabers: Zaporozhye State University (UA)
Adresse für die Korrespondenz:
Startdatum des Patents: 1992.09.03

Usage: Medizin und in Hinblick auf die Identifikation in den menschlichen aktivierten T-Lymphozyten. Das erfindungsgemässe Verhalten Blutentnahme von einem Finger oder einer Vene in Röhrchen, die gerinnungshemmende, isolierten Lymphozyten zur Herstellung von spontanen Rosettenbildung abgeleitet verwendeten Lymphozyten mit roten Blutkörperchen von Schafen ohne kalte Inkubation ( "immediate outlet") und die Anzahl der Lymphozyten, mehr als 10 rote Blutkörperchen von Schafen zu befestigen, bestimmt wird aktiviert . Das Verfahren ermöglicht die Objektivität der Auswertung zu erhöhen, um die Definition zu vereinfachen und die Zeit der Analyse der funktionellen Aktivität von Lymphozyten direkt in den menschlichen Körper zu reduzieren.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, insbesondere auf Verfahren zur immunologischen Studien und betrifft die Identifizierung in den menschlichen T-Lymphozyten aktiviert.

Bekannte Verfahren für T-Lymphozyten im Blut zu bestimmen, einschließlich der Auswahl von Lymphozyten, Zugabe von Schaferythrozyten Inkubation für mindestens eine Stunde bei 4 ° C, die Herstellung von Formulierungen und deren Analyse auf der Anzahl der anhaftenden Erythrozyten [1] T-Lymphozyten Zellen nehmen mindestens drei Schaf-Erythrozyten, befestigen. Jedoch nur die Zahl der T-Lymphozyten können durch dieses Verfahren ohne die Bestimmung ihrer Aktivität im Körper bestimmt werden.

Bekannt und Verfahren für die aktivierten T-Lymphozyten in menschlichem Blut zu bestimmen, umfassend das Kultivieren Lymphozyten 48 54 Stunden lang in einem Kulturmedium von Mitogen Phytohämagglutinin (PHA) stimuliert in einer Kultur zu proliferieren vorwiegend T-Lymphozyten, die Verabreichung Colchicin Stoppen Metaphase Teilungs Lymphozyt Stufe Koch chromosomalen Zubereitungen und ihre zytogenetische Analyse [2] das Verfahren zur Analyse von Lymphozyten in das Bestehen der ersten mitotischen Teilung beruht, Assoziation akrozentrischer Chromosomen, die zytogenetische (Zeichen) des vorhergehenden Proliferation und Migration von peripheren lymphatischen Organe beim Menschen befolgt werden. Für die aktivierten Lymphozyten ohne Vereinigungen genommen und zwei Assoziieren acrocentrics durch eine Reihe von mitotischen Teilungen gebildet ist, die, wenn sie die Assoziation zerstört werden. Diese Methode ist recht komplex, unzugänglich für die Masseneinführung von (notwendigen knappen Reagenzien, teure Geräte), und auch eine gewisse handwerkliche erforderlich (es ist notwendig, Zellen unter sterilen Bedingungen zu kultivieren, die Teilung der Colchicin-Zellen zu stoppen, können die Chromosomen nur in der Metaphase der Mitose untersucht werden) ( der Wert der Zellkultur, der Besitz von zytogenetischen Methode). Dieses Verfahren ist nicht ausreichend Ziel, als Teil der Lymphozyten in Kultur abgetötet werden und nicht alle der lebenden Lymphozyten geben Sie die mitotischen Zellzyklus während der Fixierung.

Das Ziel des Verfahrens ist die Objektivität der Auswertung, die Vereinfachung der Definition zu erhöhen und die Zeit der Analyse der funktionellen Aktivität von Lymphozyten direkt in den menschlichen Körper zu reduzieren.

Das Ziel durch die Tatsache erreicht, daß bei dem bekannten Verfahren, das die Aktivität von Lymphozyten Rest Anzeichen von antigen-Aktivierung und Proliferation in den peripheren Lymphorganen Bestimmung, führen spontane Rosettenbildung mit Schaf-Erythrozyten ohne die kalte Inkubation ( "immediate outlet"), in einer Zubereitung Berücksichtigung der Anzahl der anhaftenden Erythrozyten für T-Lymphozyten (Avidität), und die Anzahl der T-Lymphozyten, mehr als 10 rote Blutkörperchen von Schafen zu befestigen, aktiviert wird, bestimmt.

Vergleichsanalyse der beanspruchten Lösung des Prototyps zeigt, dass das vorgeschlagene Verfahren aus der bekannten Tatsache unterscheidet, dass die Anzahl der aktivierten T-Lymphozyten durch Analyse der Avidität von T-Lymphozyten auf Schaferythrozyten in einem Abstrich, hergestellt bei den Staging der spontanen Rosettenbildung mit Schaf-Erythrozyten ohne Suspension Inkubation ( "immediate Auslass bestimmt "). Für die aktivierten T-Lymphozyten werden durch mehr als 10 Schaferythrozyten befestigen. Die so erhaltene Probe von Lymphozyten ist nicht notwendig zu kultivieren, kann darüber hinaus das Volumen (0,5 ml 0,6) minimiert werden, und ermöglicht es objektiv Lymphozyten aus Vollblut zum Testen Buchsen unterscheiden, die stark das Verfahren vereinfacht und macht es für die Forschung skreniruyuschih erhältlich. Damit erfüllt die beanspruchte Lösung das Kriterium der "Neuheit".

Es gibt technische Lösungen Staging Verfahren der spontanen Rosettenbildung mit Schaf-Erythrozyten ohne die kalte Inkubation ( "immediate outlet") (2, 4, 5). Allerdings sind diese technischen Lösungen (3, 4, 5) wurde nicht isoliert und funktionell gerechtfertigt Avidität Klasse von T-Lymphozyten, mehr als 10 rote Blutkörperchen von Schafen zu befestigen, wodurch andernfalls das Ziel zu erreichen, nämlich die aktivierten T-Lymphozyten im Körper zu verteilen. Daher Methoden (3, 4, 5) die Schaffung und "unmittelbaren Stellen" sind eher quantitativ als qualitativ bewerten.

Keine technische Lösungen bekannt, bei denen die Blutlymphozytenaktivität durch die Anzahl der an ihnen rote Blutkörperchen von Schafen in den Prozess der Einrichtung sofort Auslass bestimmt. Bestimmung der aktivierten T-Lymphozyten Rosetten-Test ohne Kalt Fraktion durch Inkubation vysokoavidnyh Lymphozyten Schaferythrozyten (Anfügen mehr als 10 Schaf-Erythrocyten) bei der Herstellung ist ausdrücklich nicht Stand der Technik sein. Dementsprechend trifft die beanspruchte Lösung das Erfordernis der "erfinderischen Tätigkeit".

Das vorgeschlagene Verfahren ist wie folgt. Zuführen Blutentnahme aus der Fingervenen oder in Röhrchen mit einem Antikoagulans, isolierten Lymphozyten, wurde deren Konzentration auf 2,0 · 10 & sup6 ; Zellen pro 1 ml der Nährstoffmischung , bestehend aus 199 - Medium und 10% fötalem Rinderserum , adsorbiert an Schafen und menschlichen Erythrozyten, für 30 Minuten bei 56 o C inaktiviert. Dann wurden 0,1 ml der Lymphozytensuspension wurde mit 0,1 ml einer 0,5% igen Suspension von gewaschenen Schaferythrozyten in dem gleichen Medium wie die Lymphozyten verdünnt gemischt. Die Zellen für 10 Minuten bei 37 o C in einem Inkubator inkubiert, zentrifugiert 5 Minuten bei 200, festen Sockeln 0,05 ml 3% für 20 Minuten bei Raumtemperatur Zugabe gewaschen frei von überschüssigem Halte Glutaraldehydlösung (pH 7,2 7,4) Wasser und Zentrifugation bei 1000 U / min für 5 Minuten destilliert. Der Überstand wurde entfernt, wobei ein Volumen von 0,1 0,2 ml verlassen, in dem die Zellen vorsichtig resuspendiert und vorbereitet entfetteten Ausstriche auf Objektträgern. Smears fixiert 5 min in Methanol und gefärbt mikroskopiruyut. Die Studie Formulierung auf 400 Lymphozyten in vier verschiedenen Stellen des Arzneimittels. Rozetkoobazuyuschie Lymphozyten sind in drei Avidität Klasse 1 Klasse 3 6 Fix die Schaf-Erythrozyten, 2. Klasse 6 und 10 dritte Klasse von mehr als 10 Schaf-Erythrozyten. Endlich bestimmten Klasse Anteil aktivierten T-Lymphozyten zum Zeitpunkt der Blutentnahme für die Analyse.

Die Grundlage für die Behauptung, dass eine Subpopulation der zirkulierenden Lymphozyten auf, mehr als 10 Schafe roten Blutkörperchen verbindet, ist eine Teilmenge von aktivierten Lymphozyten, sind der Beweis für ihre besondere Dynamik gesunder und kranker Personen (siehe Tabelle.), Aber auch erkannt hoch (r 0,8 - 0,9 ) positive Korrelation des Anteils der Lymphozyten mit einer Frequenz von Klassen von Lymphozyten ohne den Verband und zwei assoziieren acrocentrics. Nach dieser zytogenetische Klassen von Lymphozyten zum Prototyp und werden durch Antigene aktiviert werden, in den peripheren lymphoiden Organen nach einer Reihe von Mitosen mit dem Immunogen gebildet. Eine hohe positive Korrelation zwischen den verglichenen Zahlen auf verschiedenen Wegen erhalten werden, zeigt die Gleichförmigkeit des unter Subpopulationen von zirkulierenden Lymphozyten analysiert. Es handelt sich um Mitglieder einer Subpopulation postproliferativnogo Lymphozytenpool, gebildet neu in den peripheren lymphatischen Organen bei immunogenesis in Reaktion auf Antigene im Körper und viele Selbst-Antigene. Folglich werden diese Lymphozyten aktiviert. Nach einer Reihe von mitotischen Teilungen (6-10 mal), wandern aktivierte Lymphozyten-Subpopulationen aus dem peripheren lymphatischen Organen in den allgemeinen Kreislauf und für die Analyse verfügbar wird Blut in Zeichnung. Beim Verschieben von Chromosomen Chromosomen Vereinigung zerstört oder ist die Mindestzahl, das heißt, sie bilden eine Klasse von Lymphozyten ohne den Verband und zwei Assoziieren acrocentrics. Darüber hinaus ist die neu gebildeten T-Lymphozyten eine hohe Dichte von Membran Typ 2-Antigene. Daher sind sie vysokoavidnymi auf Schaferythrozyten und in Kontakt mit ihnen mehr als 10 Schaferythrozyten befestigt. In den langen Umlauf (Tage, Wochen, Monate) von intakten Lymphozyten Dichte Typ 2-Antigene reduziert, da stadiodiferentsirovanny dieses Antigen vor allem in den Prozessen antigennezavisimoy Lymphozytenaktivierung beteiligt ist. Folglich nicht aktivierten (vorübergehend intakt) T-Lymphozyten werden weniger (<10), Schaf rote Blutzellen angebracht.

Die Häufigkeit der aktivierten Lymphozyten unter den zirkulierenden Pool von Lymphozyten hängt von der Intensität ihrer Bildung in perfiericheskih lymphoiden Organen, sondern auch auf die Aktivität und die Richtung ihrer Migration in die antigen pathologischen Fokus, wie in der Tabelle berücksichtigt.

Wir untersuchten die Häufigkeit von aktivierten Lymphozyten mittels des beanspruchten Verfahrens und Prototypen in der nächsten Kontingent von Personen:

  • Gesunde Spender 10 Personen;
  • onkogenen Patienten mit exsudativer Pleuritis kantseroznoy Ätiologie von 9 Personen.

Die Tabelle zeigt die Häufigkeit der Rosette T-lifotsitov durch ein Verfahren der Kalt Inkubation insgesamt T-Lymphocyten kennzeichnende und ohne Kalt Inkubation "immediate outlet" charakterisierende Subpopulation T-limifotsitov mit erhöhter Rezeptordichte auf Schaf-Erythrozyten (Typ-2-Antigen) .

Die Tabelle zeigt, dass die Häufigkeit der "immediate Buchsen" in allen Proben von Lymphozyten deutlich kleiner als die Frequenz des gemeinsamen Auslässen und entspricht der Daten literaty [3] Ohne die Kalt Inkubationsdauer einen Auslass nur Zellen mit höherer Dichte von Rezeptoren CD 2. Analyse der Häufigkeit der Blut Avidität Klassen zu bilden, und Pleuraexsudat zeigt, dass nur die zugehörige T-Lymphozyten in die dritte Klasse an der unmittelbaren Austrittsventil Verfahren zeigen charakteristisch für die immunologische Situation Dynamik vysokoavidnye. Somit wird die Frequenz der Lymphozyten im Pleuraexsudat 1.5 2 oder mehr mal größer als die Frequenz der Lymphozyten im Blut von mehr als 10 rote Blutkörperchen von Schafen zu befestigen. Eine solche Dynamik im Blut und Plasma wurde für die Klasse von Lymphozyten ohne den Verband und zwei Assoziieren acrocentrics (KL 0 + 2) nachgewiesen.

Wenn korrelativen Analyse KL Frequenz 0 + 2 in dem Blutplasma und festgestellt, dass die zytogenetische Aktivität von T-Lymphozyten signifikant hoch war (r 0,82 und 0,85 jeweils) korreliert nur mit der Frequenz von T-Lymphozyten, trat mehr als 10 rote Blutkörperchen von Schafen bei der Herstellung von Verfahren Rosette ohne kalte Inkubation.

Solche Unterschiede von aktivierten T-Lymphozyten in tsitonneticheskom und Rosette Tests im Blut und Pleuraexsudat entstand durch eine Umschichtung, dh die Migration aus dem Blut und Ablagerung in der Lunge, wo das Antigen leistungsstarke Fokus lokalisiert ist (Metastasierung).

Im Blut von gesunden Spendern, die durchschnittliche Frequenz von "unmittelbaren Stellen" und niedrigere Gesamt Steckdose und diese Reduktion war aufgrund der Anteil der T-Lymphozyten-vysokoavidnyh dritten Klasse. Außerdem zwischen ihnen und der Frequenz des CR 0 + 2 hatte eine stärker positive Korrelation.

Die daraus resultierende dynamische Frequenz vysokoavidnyh auf Schaf-Erythrozyten T-Lymphozyten und deren enge Korrelation mit der Frequenz des CR 0 + 2 bestätigen ihre immunologische Aktivität. Folglich wird die Rate der Frequenz von T-Lymphozyten, mehr als 10 rote Blutkörperchen von Schafen in dem Test "immediate outlet" trat ein Funktionstest der Aktivität von T-Lymphozyten zirkulierende. Die Gesamtfrequenz Indikatoren Rosette Lymphozyten mit und ohne Kalt kalte Inkubation Tests sind quantitative und nicht signifikant mit der funktionellen Indikatoren der T-Lymphozyten korreliert.

Zirkulierende T-Lymphozyten Körper, zusammen mit einem 10-Schaf-Erythrozyten haben eine höhere Dichte entsprechende Rezeptoren (Typ 2-Antigene) als Hinweis auf ihre vorherige Restaktivierung in peripheren Lymphorganen. Typ-2-Antigen wird in Zell-Zell-Kontakten, Antigen- verursacht (unspezifisch) die Proliferation und Differenzierung von Lymphozyten komitirovannyh [6] Die Komplementarität zu Schaferythrozyten und damit die Verbindung mit ihnen durch Unfall verwickelt. Dies wird durch eine Erhöhung der Avidität von Lymphozyten (die Anzahl der anhaftenden Erythrozyten) veranschaulicht in ihrer unspezifischen mitogene Stimulation von Lectinen in den Kulturbedingungen in vitro, in einer Stunde nach der Zugabe von Mitogen (PHA, konkavanavalina Mitogen pokeweed), selbst in der Abwesenheit von DNA Synthese [7, 8]

Folglich ist eine Erhöhung der Dichte von Typ-2-Antigen ein frühes Zeichen der Aktivierung von T-Lymphozyten. In den peripheren lymphoiden Organen und antigenspezifischen Lymphozyten nach Aktivierung antigennespetsificheskoy Blastenzellen mit einer hohen Dichte von CD2-Antigen transformiert und daher mit hoher Avidität an Schaf-Erythrozyten. Dann dividieren diese Zellen mitotisch 10. Juni einmal differenzierten Klon antigenreaktivnyh T-Lymphozyten, welche die lymphoiden Organe verlassen, einschließlich des Pools von T-Lymphozyten zirkulierende. Die neu gebildeten T-Lymphozyten behalten eine hohe Dichte an Rezeptoren-2-Diabetes und machte in Einnahme einer Blutprobe zur Analyse zur Verfügung. Während der weiteren Ontogenese von T-Lymphozyten-Dichte Membran-Antigen Typ-2-Diabetes verringert.

Damit die Dynamik vysokoavidnyh T-Lymphozyten, mehr als 10 rote Blutkörperchen von Schafen befestigen, durch "instant socket" operativ und Intensitätssteuerung der Proliferation und Migration von aktivierten T-Lymphozyten wurde bestimmt; ihre Umverteilung in den Körper zu Orten der Ablagerung von Antigenen; studieren die Intensität der Immunität und seine Korrektur mit immunotropen Therapie.

QUELLEN VON INFORMATIONEN

1. EF Chernushenko, LS Kogosova, SI Gontscharowa und andere. Einheitliche immunologische Methoden der Untersuchung von Patienten in der stationären und ambulanten Behandlung. Methodische Empfehlungen. Kiew, 1988, 18, S..

2. AK Frolov VK Frolov. Verfahren zur aktivierten T-Lymphozyten im Blut zu bestimmen. AS N 1024839 01 C 33/50, 1986 ein Prototyp.

3. G. Frimel. Immunologische Methoden / hrsg. mit ihm. M. Medicine, 1987, 472 p.

4. Cheredeyev, DV Pledra, KK Stolongo. Die Studie der spontanen rosettenbildenden Zellen in menschlichen peripheren Blut. Lab. Unternehmen, 1976, N 6, 350-354 p.

5. J. I. Karpov DE Mokhov, NI Volkov. Die Reaktion spontan Rosette Lymphozyten aus dem Blut Kapillare isoliert. Lab. Unternehmen, 1984, N 7, 427-429 p.

6. Klinische Immunologie und Allergologie. In drei Bänden. T. 1. Trans. mit ihm. / Ed. Jaeger. 2nd ed. überarbeitet und erweitert. M. Medicine, 1990, 528 p.

7. Ju David, Tar Januar Heman lymphosyte subpomilation: gigant menschliche rote Blutzelle rosetfes J. Jmmand. Meth. 1977 v.15 N1. Seite 67 76.

8. Richie E. Patchen M. Korrelation und Lymphozyten-Engagement achivation. Ceen. Jmnuind. N 73). V 11. N 1978 1, p. 88 97.

FORDERUNGEN

Verfahren zur aktivierten T-Lymphozyten im menschlichen Körper zu bestimmen, Blutentnahme einschließlich und Isolieren von Lymphozyten von diesem, dadurch gekennzeichnet, dass eine Formulierung mit Lymphozyten mit Schaferythrozyten spontane Rosettenbildung erhalten ohne Kalt Inkubation und die Anzahl der Lymphozyten, bringen mehr als 10 aktiviert Schaf-Erythrozyten bestimmen T Lymphozyten im Körper.

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Erscheinungsdatum 02.04.2007gg