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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2202796

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER FÄHIGKEIT menschlichen Erythrozyten sorbiert Prednisolon

Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit, menschliche Erythrozyten ERMITTLUNG
sorbierten Prednisolon

Name des Erfinders:. Kirda EG; Dmitrieva LA. Belokhvostikova TS
Der Name des Patentinhabers: Staatliches Institut für Traumatologie und Orthopädie NTSRVH AESS SB RAMS
Korrespondenzanschrift: 664003, Irkutsk, st. Fighters Revolution, 1, Institut für Traumatologie und Orthopädie NTSRVH AESS SB RAMS, Patent Gruppe, R.N.Harlamovoy
Startdatum des Patents: 2000.01.10

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, insbesondere auf Immunologie. Das Verfahren verbessert die Wirksamkeit der Behandlung durch die einzelnen Sorptionsaktivität der roten Blutzellen zu Prednisolon auf die Verwendung des komplexen therapeutischen Maßnahmen immunopharmacotherapy des Patienten zu bestimmen. Durchführung der Zell Einstellung Immunadsorption und Erhalten der Überstand der Reaktion, während die ausgewählte roten Blutzelle mit einer Lösung von Prednisolon in einer Konzentration von 1 ug / ml in gleichen Volumina für 60 Minuten inkubiert, zentrifugiert und der Überstand gewonnen und dann eingeführt in die erste Probe von 0,05 ml 199-Medium, sekundär - 0,05 ml Lösung von Prednisolon in der Anfangskonzentration und der dritten - 0,05 ml des Überstands nach der Inkubation mit roten Blutkörperchen Prednisolon erhalten, und dann wurden alle Proben 0,05 ml einer Lösung von Nitroblautetrazolium zugegeben und 0,1 ml Vollblut des Patienten dann inkubiert, zentrifugiert, der Überstand vom Zellpellet entfernt Ausstriche herzustellen, mit Methanol fixiert und mit Neutralrot gefärbt, der Prozentsatz von Neutrophilen wurden im Cytoplasma enthaltenden Granula diphormazane dann beurteilen die biologische Aktivität von Prednisolon in der ersten Versuchsprobe die prozentuale Reduktion gezählt NTS- Neutrophilen-Aktivität im Vergleich zu der Kontrollprobe ohne Prednisolon und Sorptions-Aktivität wird aus der Differenz der roten Blutkörperchen in der Probe mit dem Überstand und in der Probe mit einer Lösung von Prednisolon bestimmt.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, insbesondere für Immunologie, und kann mit verschiedenen therapeutischen Interventionen von chronischen Entzündungserkrankungen in Kombination verwendet immunopharmacotherapy autoerythrocytes geladen, beispielsweise Prednisolon angewendet werden Hyperaktivierung des Immunsystems Funktionen beteiligt sind .

In der Nähe von dem vorgeschlagen wird, ist ein Verfahren zur Sorption Aktivität des Rezeptors Vorrichtung menschlicher Erythrozyten zu bestimmen. Der Kern des bekannten Verfahrens ist wie folgt: das Blut des Patienten in einer Menge von 5,4 ml in ein Teströhrchen, das 0,1 ml von 2500 Einheiten Heparin genommen wird, Erythrozyten wurden für 5-7 Minuten bei 1500 U / min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung dreimal durch Zentrifugation gewaschen. . Gewaschenen Erythrozyten werden mit PBS verdünnt, um eine 5,3% ige Suspension und 1,5 ml der erhaltenen Suspension wurde bei Raumtemperatur für 40-45 Minuten mit 1,5 ml verdünntem Maus-Seren inkubiert, zu erhalten. Nach der Inkubation wurde die Mischung zentrifugiert und die optische Dichte des Überstandes gegenüber der Kontrollprobe mit einem Spektrophotometer. Die Kontrollprobe von 1,5 ml wird Verdünnungen von Maus-Serum, an das 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung und behandelt werden, und als Versuchsprobe hinzugefügt wird. Der resultierende Wert wird mit dem durchschnittlichen Spender Kontrolle verglichen und der Unterschied spiegelt die Sorption Aktivität von Rezeptor-System von menschlichen Erythrozyten (1).

Jedoch hat das bekannte Verfahren bestimmte Nachteile auf, nämlich:

  • eine bekannte Methode, um die Sorption Aktivität der Bestimmung gibt einen Hinweis auf den Funktionszustand des Rezeptors Vorrichtung menschlichen roten Blutzellen und der Prognose in Bezug auf die Wiederherstellung, während, wie das vorgeschlagene Verfahren die Sorption Aktivität von Erythrozyten in Bezug auf einen bestimmten Wirkstoff und die Möglichkeit der komplexen therapeutischen Maßnahmen angewendet werden können, um zu bewerten immunopharmacotherapy Verwendung autoerythrocytes beladen mit Prednisolon für Hyperaktivierung des Immunsystems verschiedene Krankheiten beteiligt sind.

die Wirksamkeit der Behandlung erhöhen, indem die einzelnen Sorptionskapazität des Patienten roten Blutkörperchen zu Prednisolon auf die Verwendung des komplexen therapeutischen Maßnahmen immunopharmacotherapy Bestimmung: Basierend auf dem Stand der Aktivitätserkennung Technologie Erythrozyten Sorption wurde beauftragt worden.

Die Aufgabe wird wie folgt gelöst.

Bestimmung der Fähigkeit von menschlichen Erythrozyten wird durch Performances Prednisolon Immunadsorption und Erhalten der Zellüberstand Reaktions sorbieren. Die vorgeschlagene neue Verfahren ist, daß die roten Blutzellenauswahl mit einer Lösung von Prednisolon in einer Konzentration von 1 ug / ml in gleichen Volumina für 60 Minuten inkubiert, zentrifugiert und der Überstand wurde erhalten. Dann wird die erste Probe wird aus 0,05 ml Medium 199, einer zweiten Probe 0,05 ml Prednisolon-Konzentration in der Ausgangslösung und in der dritten Probe von 0,05 ml des Überstandes nach Inkubation mit roten Blutkörperchen Prednisolon. Dann wurden alle Proben 0,05 ml einer Lösung von Nitroblautetrazolium zugegeben und 0,1 ml Vollblut des Patienten. Dann inkubiert, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Aus dem Zellpellet Ausstriche herzustellen, mit Methanol fixiert und mit Neutralrot gefärbt wurden der Prozentsatz an Neutrophilen in das Cytoplasma enthaltenden Granula diphormazane gezählt. Dann beurteilen die biologische Aktivität von Prednisolon in dem ersten experimentellen Probe die prozentuale Reduktion der Neutrophilen HCT-Aktivität im Vergleich zu einer Kontrollprobe ohne Prednisolon und Sorption Erythrozyten-Aktivität aus der Differenz der Probe mit der Prednisolon-Lösung in der Anfangskonzentration in der Probe mit dem Überstand zu bestimmen, und die Detektion von Unterschieden zwischen diese Zahlen mehr als 5% wird durch die Verwendung der extrakorporalen immunopharmacotherapy autoerythrocytes mit einer Lösung von Prednisolon nützlich erachtet.

Erklärt wesentliches Merkmal des vorgeschlagenen Verfahrens immunopharmacotherapy.

Während der Inkubation mit einer Lösung aus Prednisolon roten Blutkörperchen Erythrozyten fähig sind nicht spezifisch adsorbieren und sich auf ihrer Oberfläche und Prednisolon, wenn eine regulierende Wirkung auf die Lymphoproliferation Prozessen zugrundeliegenden Immunantwort ausüben, verabreicht.

Erhalten nach Inkubation und Zentrifugation roten Blutkörperchen Lösung auf eine Konzentration von Prednisolon in den ursprünglichen Überstand verwendet zum Einstellen NBT-Test, um die Sorptionskapazität von Erythrozyten zu bewerten, die von dem Grad der Häufigkeit der biologischen Aktivität von Prednison nach der Inkubation mit den Erythrozyten bestimmt.

Die erste Probe mit 0,05 ml 199-Medium wird als Referenz zum Vergleich mit den Testproben verwendet.

Die zweite Probe mit 0,05 ml einer Lösung von Prednisolon in einer Konzentration von 1 ug / ml verwendet, um die biologische Aktivität von Prednisolon zu bewerten, verglichen mit der Kontrollprobe.

Eine dritte Probe mit 0,05 ml des Überstands nach der Inkubation Prednisolon ursprünglichen Konzentration roter Blutkörperchen erhalten wurde verwendet, um die Sorptionskapazität der Erythrozyten in dem Grad der Häufigkeit der biologischen Aktivität des Arzneimittels zu bewerten, im Vergleich zu einer zweiten Probe.

Hinzufügen aller Proben löslichen Farbstoff Nitroblautetrazolium 0,05 ml und 0,1 ml des Vollbluts aus dem Patienten, gefolgt von einer Inkubation in einem Inkubator bei 37 o C ist Zentrifugierung erforderlich zur Herstellung von Ausstrichen und bestimmen den Anteil der neutrophilen Granulozyten im Cytoplasma enthaltenden Granula diphormazane unlöslich.

Prednisolon biologische Aktivität wird durch den Prozentsatz von Neutrophilen NBT-Reduktionsaktivität in der Probenlösung mit der Zugabe von Prednisolon in einer Anfangskonzentration im Vergleich zu der Kontrollprobe ohne Prednisolon beurteilt.

Das Vorhandensein und die Größe der Sorption Aktivität von Erythrozyten aus der Differenz der Probe mit dem Überstand und der Probe mit einer Lösung von Prednisolon in der Anfangskonzentration berechnet.

5 Prozent Unterschied in der Berechnung nicht berücksichtigt die Kollision NBT-positiven Zellen und umfasst zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, wenn sie auf die Angemessenheit eines bestimmten Patienten mit extrakorporalen immunopharmacotherapy autoerythrocytes behandelt mit Prednisolon in den komplexen therapeutischen Maßnahmen zu entscheiden.

Durchführung von Patentrecherchen von der Unterklasse G 01 N 33/53, A 61 K 37/02 und Analyse von wissenschaftlichen und medizinischen Informationen, die den aktuellen Stand der Methoden zur Bestimmung der Sorptionskapazität von roten Blutkörperchen aus dem peripheren Blut reflektiert haben nicht die Technologie offenbart, identisch vorgeschlagen. Somit ist das vorgeschlagene Verfahren menschlichen Erythrozyten sorb Prednisolon des Bestimmens neu.

Das Verhältnis und die Wechselwirkung der grundlegenden Techniken der vorgeschlagenen Methode die Fähigkeit von menschlichen Erythrozyten Bestimmung sorbirovat Prednisolon neue medizinische Ergebnis in der Aufgabe erreicht, nämlich die Wirksamkeit der Behandlung zu erhöhen, indem die einzelnen Sorptionskapazität des Patienten roten Blutkörperchen zu Prednisolon bestimmen.

Das vorgeschlagene Verfahren kann in der medizinischen Praxis verwendet werden, da es immer wieder reproduziert werden kann und keine teure Ausrüstung und Reagenzien erfordern.

Das Wesen des Verfahrens für die Fähigkeit von menschlichen Erythrozyten Bestimmung sorb Prednisolon ist wie folgt.

Produzieren Patienten Blutprobe aus dem Cubitalvene in sterile Heparin mit einer Rate von 25 Einheiten pro 1 ml Blut, von denen einige verwendet, um rote Blutkörperchen zu erhalten, indem dreimal in isotonischer Kochsalzlösung zu waschen. Gleiche Volumina von gewaschenen roten Blutkörperchen und Prednisolon - Lösung in einer Konzentration von 1 ug / ml wurde im Thermostaten bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Aufschlämmung bei 1000 U / min für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand entfernt, die in weiteren Untersuchungen verwendet wurde. Staging NBT-Test wird in Platten für immunologische Untersuchungen durchgeführt. Die erste Probe wurde eingeführt, 0,05 ml Medium 199, die zweite - 0,05 ml Lösung von Prednisolon bei einer Konzentration von 1 mg / ml, in der dritten - 0,05 ml Überstand nach poduchennoy eritrosorbtsii. In allen Proben Nitroblautetrazolium Lösung wurde in einem Volumen von 0,05 ml und 0,01 ml Vollblut des Patienten eingeführt. Proben wurden in einem Thermostaten bei 37 ° C und für 30 Minuten, zentrifugiert für 10 Minuten bei 1000 U / min inkubiert. Aus dem Zellpellet Abstrichen, mit Methanol fixiert, gefärbt mit Neutralrot vorzubereiten und den Prozentsatz an Neutrophilen im Cytoplasma enthaltenden Granula diphormazane (NBT-positiven-Zellen) zu bestimmen.

Die biologische Aktivität von Prednison in der Probe in seine Anfangskonzentration in der Probe und mit dem Überstand nach Inkubation mit roten Blutkörperchen Lösung Prednisolon, berechnet als Prozentsatz der NBT-reduzierende Aktivität der neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu einer Kontrollprobe ohne Anzeichen von Prednisolon. Sorption Aktivität von menschlichen roten Blutzellen zu Prednisolon wird aus der Differenz der Probe mit dem Überstand und in der Probe mit einer Lösung aus Prednisolon und Nachweis von Differenzen zwischen diesen Indikatoren mehr, berechnet als 5 Prozent nützlich erachtet wird durch extrakorporale immunopharmacotherapy autoerythrocytes Verwendung mit einer Lösung von Prednisolon behandelt.

Das Wesen des vorgeschlagenen Verfahrens wird durch klinische Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1. Der Patient V., 52 Jahre alt. Diagnose: asymphytous diaphysäre Fraktur der rechten Tibia, chronische Osteomyelitis, IDS giposupressornogo Typ mit Anzeichen von Hyperaktivität Phagozyten.

Sorption Aktivität Erythrozyten (SAE) wurde durch die Fähigkeit von Prednisolon in einer Konzentration von 1 ug / ml untersucht , bevor die Aktivität der neutrophilen Granulozyten unterdrücken und nach der Inkubation mit den Erythrozyten, die Inkubation wurde in einem Thermostat bei 37 ° C für 1 Stunde nach dem Mischen gleicher Volumina der roten Blutkörperchen mit einer Lösung von Prednisolon durchgeführt. EPS wird als Prozentsatz des Rückgangs der biologischen Aktivität von Prednisolon nach Inkubation mit seinen roten Blutzellen berechnet.

In der Kontrollprobe wurde ohne Prednisolon Prozentsatz der NBT-Aktivität 62%. In der 1. Testprobe (mit dem Zusatz von Prednisolon in dem Quelllösungskonzentration) HCT-Aktivität von Neutrophilen betrug 46%. In der zweiten Testprobe (mit der Zugabe des Überstands nach der Inkubation von Erythrozyten mit Prednison) HCT-Neutrophilen-Aktivität - 57%. Indikator EPS lag bei 11% (57% - 46% = 11%).

In der Fähigkeit des Patienten Erythrozyten Bestimmung Prednisolon NBT Indikator nitrophilic Aktivität in der Probe mit dem Überstand nach Inkubation mit der Patienten roten Blutkörperchen Prednisolon-Lösung in der Konzentration höher als in der ursprünglichen HCT-Aktivität in der Probe mit dem Zusatz von Prednisolon erhalten zu sorbieren. Somit ist es zweckmäßig, den Patienten mit dem extrakorporalen immunopharmacotherapy autoerythrocytes mit einer Lösung von Prednisolon in Kombination mit therapeutischen Maßnahmen behandelt präsentieren Hyperaktivierung des Immunsystems zu reduzieren.

Beispiel 2. Patient D., 19 Jahre alt. Diagnose: primärem Offen infiziert einen doppelten Bruch des mittleren Drittels der rechten Tibia mit einer Verschiebung, Weichteilnekrosen im mittleren Drittel der rechten Tibia, infizierte Wunde des rechten Fußes, Mehrwertsteuer gipersupressornogo Art von Charakter mit Anzeichen von Hyperaktivität von phagozytischen Leukozyten.

In der Kontrollprobe (ohne Prednisolon) der Prozentsatz der NBT-Aktivität von Neutrophilen betrug 77%. In der 1. Testprobe (mit dem Zusatz von Prednisolon in dem Quelllösungskonzentration) HCT-Aktivität betrug 58%. In der 2. Versuchsprobe (mit der Zugabe des Überstands nach der Inkubation mit roten Blutkörperchen Lösung Prednisolon) HST Neutrophilen-Aktivität - 54%. Indikator SAE betrug 5% (58 bis 54% = 4%).

Wenn daher die Erythrocyten dieser Patient sorb Prednisolon HCT Komponente Neutrophilen-Aktivität in der Probe mit der nach der Inkubation mit den roten Blutzellenkomponente erhaltene Überstand Bestimmung übersteigt Prednisolon Natrium HCT-Aktivität in der Probe mit einer Lösung von Prednisolon Anfangskonzentration von nicht mehr als 5%. Die extrakorporale immunopharmacotherapy autoerythrocytes behandelt mit Prednisolon Verwendung ist unpraktisch aufgrund der niedrigen roten Blutkörperchen Adsorption Aktivität.

Somit erlaubt die vorgeschlagene "Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit von menschlichen Erythrozyten Prednisolon sorb" Vergleich zu bekannten Techniken, um die Wirksamkeit der Behandlung zu erhöhen, indem die einzelnen Sorptionskapazität von Erythrozyten zu Prednisolon Patienten zu bestimmen, um komplexe Anwendungen therapeutischen Maßnahmen immunopharmacotherapy.

INFORMATIONSQUELLE

1. AS UdSSR N1778707, BI 44, G 01 N 33/531.

FORDERUNGEN

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit von menschlichen Erythrozyten sorb Prednisolon durch Zell Immunsorption Reaktionseinstellung und einen Überstand zu erhalten, wobei die roten Blutzelle ausgewählt gesagt wird mit Prednisolon-Lösung in einer Konzentration von 1 inkubiert ug / ml in gleichen Volumina für 60 Minuten zentrifugiert und der erhaltene Überstand, und dann die erste 0,05 ml Testmedium wird 199, die zweite aus - 0,05 ml Lösung von Prednisolon in der Anfangskonzentration in der dritten und 0,05 ml des Überstandes nach Inkubation mit roten Blutkörperchen Prednisolon, und dann wurden alle Proben 0,05 ml einer Lösung von Nitroblautetrazolium hinzugefügt und 0,1 ml Vollblut des Patienten, und dann inkubiert, zentrifugiert, der Überstand vom Zellpellet entfernt Ausstriche herzustellen, mit Methanol fixiert und mit Neutralrot, der Prozentsatz von Neutrophilen wurden im Zytoplasma gezählt Granula diphormazane dann die biologische Aktivität von Prednisolon evaluieren erste experimentelle Probe der Prozentsatz von NBT-reduzierenden Aktivität von Neutrophilen im Vergleich zu einer Kontrollprobe ohne Prednisolon und Sorptions-Aktivität wird aus der Differenz der roten Blutkörperchen in der Probe mit dem Überstand und in der Probe mit einer Lösung von Prednisolon bestimmt.

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Erscheinungsdatum 02.04.2007gg