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Erfindung
Russische Föderation Patent RU2019186

METHOD Hemmung der HIV-Infektion

METHOD Hemmung der HIV-Infektion

Name des Erfinders:. Bykovskii AF; Miller GG. Pokidysheva LN. Titow IV. Artyukov AA. Popov Uhr. Prozorovsky SV. Loenko YN. Joseph Hess [US]; Elyakov G.B. Stonik VA. Isakov VV
Der Name des Patentinhabers: Wissenschaftliche Forschungsinstitut für Epidemiologie und Mikrobiologie im.N.F.Gamalei; Pacific Institut für Bioorganische Chemie
Adresse für die Korrespondenz:
Startdatum des Patents: 1991.02.28

Verwenden: in der Medizin, insbesondere zur Verhütung und Behandlung von AIDS und AIDS-verwandten Erkrankungen. Das erfindungsgemässe Verfahren verwendet eine niedermolekulare sulfatierte Polysaccharid mol. c. weniger als 20.000 Daltons mit Fucose, 4-Position sulfatiert, mit der Uronsäure bei einem Verhältnis von 1 deren Reste durch glykosidische Bindungen verbunden sind, und korreliert: 4 (SO 3 -FUC, UA = COOH), während auf das Ausgangsmaterial Alge Laminaria japonica erhalten. Der positive Effekt: niedrige Polysaccharid Maulwurf sulfatierte. c. Es zeigt keine Toxizität gegenüber Zellen in vitro bei Dosen von mehr als 5000 ug / mg.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf die Medizin, insbesondere zur Verhütung und Behandlung von AIDS und AIDS-verwandten Erkrankungen.

Bekannten Methode die Hemmung der HIV-Infektion durch Fucoidan.

Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass das Fucoidan toxisch.

Das Ziel der Erfindung ist die Toxizität zu verringern.

Dieses Ziel wird durch die Verwendung niedermolekulares sulfatiertes Polysaccharid (NSP) mit mol.v. erreicht etwa 15.000 Dalton, enthaltend Fucose, 4-Position sulfatiert, die Reste , die durch glycosidische Bindungen und korrelierten mit Uronsäuren in einem Verhältnis von 1 verknüpft sind: 4 (SO 3 -FUC; UA-COOH), wobei das Ausgangsmaterial aus Algen Laminaria japonica erhalten ( Laminaria japonica).

CNP hat die folgenden Eigenschaften.

Physikalische Beschreibung des Polysaccharid. Material und Methoden.

Die chromatographische Analyse wurde mit einem hydrophoben Sorbens polychrome-1 und Sephacryl S-300 (Pharmacia, Schweden) auf einer Glassäule unter Verwendung von Q1 UV-VIS-Detektor (bei 254 nm, 2 ml präparative Flußzelle). Kohlenhydrate bestimmt durch Phenol-Sulfatverfahren.

Für Monosaccharid - Analyse unter Verwendung von Gas - Flüssigkeits - Chromatographie auf 2 Licht-Chromatographen mit einer Glassäule mit 2,5 x 0,4 cm (3% OV-225 auf dem Chromatron N-HMDS) bei etwa 150 bis 230, ca. 5 / min.

durch Erhalten Peracetat algitola herkömmliche Weise Proben für die Analyse wurden mit 2N HCl, anschließend für 2 Stunden durch Hydrolyse eines Polysaccharid - Zubereitung bei 90 ° C hergestellt.

Magnetisches Kernresonanzspektrum (H und 13 C - NMR) wurden Spektrometer Bryker WM-250 gemessen. Die chemischen Verschiebungen wurden in ppm von tetrametilksilana aufgezeichnet.

Ergebnisse.

NSP (MW etwa 15.000 Dalton), weißes amorphes Pulver; [ ] 25 = 27,813 C - NMR (D 20); 102,4; 101,2; 100,7; 99,1 ppm (C-1) 13 C NMR (D 2 O); Alginat: 102,4; 101,2; 100,7 (C-1), 71,2; 71,8; 66,0 (C-2), 72.6; 72,8; 70,5 (C-3), 79.2; 801.1 (C-4), 772; 682 (P-5), 176,1; 175,8; 175,6 (C-6) Fucoidan: 99,1 (C-1), 74,9 (C-2), 67,9 (C-3), 81,3 (C-4) 67,9 (C-5) 17,2; 16,6 (C-6).

13 C - NMR - Spektrum wurde mit einem Spektrometer WM-250 (Bryker) gemessen.

Somit wird gezeigt, daß die Polysaccharidfraktion mit einer niedermolekularen Komponente von Fucose, sulfatierte 4-Position und seiner gebunden bleibt -1,2 Glykosid- und korreliert mit Uronsäuren (mannurovoy und Guluron-) im Verhältnis 1: 4 (SO3-FUC: UA-COOH).

Die biologischen Eigenschaften des Polysaccharids.

BEISPIELE Beispiel 1: Hemmende Wirkung gegen IPV Adsorption von HIV-1-Virus und zytopathische Wirkung auf die MT4-Zellen wurde wie folgt bestimmt:

a) direkte antivirale Wirkung

1 ml einer Suspension von HIV-1 nach einer Hochgeschwindigkeits - Zentrifugation des Virus-enthaltende Kulturflüssigkeit von H9 / IIIB - Zellen oder NTN1U 27 und 1 ml der erhaltenen Lösung zu CNP - Konzentrationen entspricht (0,1 bis 100 & mgr; g / ml) wurde in ein Teströhrchen gegeben und man ließ für 2 h zu kontaktieren bei 37 ° C oder Raumtemperatur. Danach wurden eine gleiche Anzahl von Zellen MT4 vorbehandelt mit Polybren in jedes Röhrchen gegeben , das Virus bei einer Multiplizität der Infektion (MI) von 100 und erlaubt zu adsorbieren bei 37 ° C für 1-1,5 h zu kontaktieren.

Nach Kontakt Zellen für 10 min durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert wurden, wurde der Überstand entfernt, die Zellen wurden in RRM1 1640 - Medium mit 10% fötalem Kälberserum bis zu einer Endkonzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml resuspendiert. Die Zellsuspension in einer Menge von 1 ml wurde in 24-Well - Platten verteilt und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 7 Tage.

b) Hemmwirkung auf die IPV Adsorption von HIV-1 auf MT4-Zellen.

Gemäß 2x10 5 Zellen / ml MT4 in jede Vertiefung von Platten mit 24 Vertiefungen verteilt und nach einer kurzen Zeit der Sedimentation der Zellen am Boden der Vertiefungen wurde die entsprechende Konzentration von CNP und vorinkubiert bei 37 ° C für 1 Stunde zugegeben, wonach eine Virussuspension mit einem MI-100 und kultiviert hinzugefügt wurde Zellen, die unter den gleichen Bedingungen sieben Tage. Der Prozentsatz der Zellen, und neekspressirovavshih virale Antigen auf der Oberflächenmembran wurde als Durchschnitt von drei Wiederholungen jeder 100-Zellen in der indirekten Immunfluoreszenz-Methode berechnet.

Das Verhältnis der X-Adsorption Hemmung der Virus wurden abhängig NSP-Konzentrationen durch die folgende Formel,% bestimmt:

wo ein - Antigen-positiven Zellen in den Zubereitungen mit NRS behandelt,%;

b - Antigen-positiven Zellen in unbehandelten Zubereitungen%

100 - Antigen-positiven Zellen in den Kontrollformulierungen (siehe Tabellen 1 und 2 ..).

NRS gerinnungshemmende Wirkung war mehr als 10 mal geringer als die von Heparin. Wenn der Wert von 50% für die Anti-HIV - Aktivität in MT4 - Zellen (.. siehe Tabellen 1 und 2) Übertragung von ug / ml IU / ml, so erhält man die folgenden Werte, Einheiten / ml: CNP 6,7h10 -3; fucoidan 3,6h10 -3; Heparin 1 x 10-3.

Somit kann die NSP anti-HIV-Aktivität bei Konzentrationen von mehr als 100-fach besitzt niedriger als seine gerinnungshemmende Aktivität.

Bestimmung von in vivo und in vitro akute Toxizität von Polysaccharidfraktion der NRS.

Bestimmung der akuten Toxizität in vivo wurden an weißen Mäusen durchgeführt (10 Tiere in jeder Gruppe), 4-5 Wochen alt, mit einem Gewicht von 21-24 g NSP in normaler Kochsalzlösung verdünnt, in geeigneten Konzentrationen, wurde auf drei verschiedene Arten an Tiere verabreicht: intravenös, intraperitoneal, oral. Leitsymptome, Sterblichkeit und Körpergewicht jedes Tieres wurde für 7-tägigen Beobachtungszeitraum untersucht, nach denen jedes Tier getötet wurde und die inneren Organe anatomischen Studie. Wie in der Tabelle gezeigt. 3, keiner von dem Tier das Medikament eine dieser Methoden empfangen, es keine Anzeichen einer akuten Toxizität oder irgendwelche Verletzungen der inneren Organe Morphologie offenbart wurde (siehe. Tabelle. 4).

Zytotoxizität EPT in vitro auf MT4 und H9-Zellen wurde nicht einmal bei Arzneimittelkonzentrationen über 5000 pg gezeigt / ml im Vergleich zu einem Prototyp Fucoidan, auf die 50% zytotoxische Dosis Zellen Überleben MT4 bestimmt ist 1060 ± 210 pg / ml oder Azidothymidin ( Sigma), die in Konzentrationen von Zellen größer als 1000 Mikrogramm / ml toxisch ist.

Somit kann die NSP kann als selbst Formel und als Komponente einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder in Kombination mit anderen bekannten Wirkstoffen wie AZT verwendet.

Die hemmende Wirkung von EPT auf dem Rücken Transkriptase-Aktivität in vitro wurde unter Verwendung von Vogel-Myeloblastose-Virus (AMV) als Quelle des Enzyms (vom Institut für Molekularbiologie und Genetik der Russischen Akademie der Wissenschaften, Kiew zur Verfügung gestellt) bestimmt. Die Tests wurden durch ein bekanntes Verfahren durchgeführt. NSP 2 mg in 1 ml sterilem destilliertem Wasser und eingestellt auf geeigneten Konzentrationen gelöst. 20 ml Volumen der Reaktionsmischung bestand aus:

50 mM Tris-HCl, pH 8,2; 5 M MgCl 2; 1 g Oligo (d ATP), RNA, pH 8.2 als eine Matrize 20 M dATP, dCTP, dTTP und 0,5 Ki 3 H-dCTP; 60 M KCl, 1 M Mercaptoethanol und in ein 1,5 ml Eppendorf - Röhrchen gegeben, die 5 min in einem Wasserbad bei 37 ° C platziert. Danach wurden 20 l der zuvor hergestellten Lösung von NSP jeweiligen Konzentrationen wurde zu der Reaktionsmischung zusammen mit 1 l der reversen Transkriptase AMV und bei 37 ° C für 1 h reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung Membran übertragen wurde filtert DE-81, gewaschen , 5 mal mit 5 -minutnymi brechen, wenn sie geschüttelt, getrocknet und in Glasbehältern mit 10 ml flüssiger Szintillationscocktail gegeben. Radioaktivität (s.r.m.) jeder Filter wurden für 1 min in einem Scintillationszähler gezählt. Der Grad der Hemmung der reversen Transkriptase-Aktivitäten (ITA) wurde berechnet durch die Formel

ITA = x 100%, wobei C ist über - steuern die Radioaktivität der Probe ohne die NRS;

C s - die Radioaktivität der Probe nach Vorinkubation mit den NRS.

Der Grad der Hemmung auf die Aktivität in der Zeichnung dargestellt.

So niedrig sulfatiertes Polysaccharid mol.v. Es zeigt keine Toxizität auf Zellen in vitro bei Dosen von mehr als 5000 Mikrogramm / ml, und in vivo in Labortieren, und kann mit billigen Abfalltechnik durch Behandlung Algen (Laminaria japonica) erhalten werden.

FORDERUNGEN

METHOD Hemmung der HIV-Infektion durch die Verwendung von sulfatierten Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, dass die Toxizität zu reduzieren, verwenden ein niedermolekulares sulfatiertes Polysaccharid mit einem Molekulargewicht weniger als 20.000 Dalton, mit Fucose, 4-Position sulfatiert, deren Reste durch glycosidische Bindungen und korreliert mit Uronsäure bei einem Verhältnis von 1 verbunden sind: 4 (SO 3 - FUC; UA - COOH) ist, wobei das Ausgangsmaterial aus Laminaria Algen japanischen vorbereitet ( Laminaria japonica).

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Erscheinungsdatum 06.01.2007gg