Начало раздела Производственные, любительские Радиолюбительские Авиамодельные, ракетомодельные Полезные, занимательные	Хитрости мастеру Электроника Физика Технологии Изобретения	Тайны космоса Тайны Земли Тайны Океана Хитрости Карта раздела
Использование материалов сайта разрешается при условии ссылки (для сайтов - гиперссылки)

ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2037289

СПОСОБ ОТБОРА ТРАНСФОРМАНТОВ ТОМАТА

Имя изобретателя: Седов Геннадий Иванович[MD]; Чесноков Юрий Валентинович[MD] 
Имя патентообладателя: Институт генетики АН РМ (MD)
Адрес для переписки: 
Дата начала действия патента: 1992.06.26 

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекционно-генетические исследования, овощеводство. Сущность изобретения: трансформанты томата отбирают при выращивании зародышей размером 2,0 - 2,5 мм на канамицинсодержащей среде HLH.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано для селекции в условиях in vitro трансформантов, полученных при генетической трансформации растений посредством переноса плазмидной ДНК в растительную зиготу с помощью прорастающей пыльцы.

Трансфекция чужеродных генов в геном высших растений проводится на уровне целого растения, его органов, отдельных тканей, клеток (соматических и генеративных) и протопластов методами сокультивирования с агробактериями или прямым переносом ДНК в растительные клетки.

Известен способ отбора трансформантов, основанный на появлении в результате трансформации у рецессивного генотипа семян с доминантными признаками [1]

Известен и способ отбора трансформантов, в основе которого появление морфологически аномальных растений или опухолей, а и синтез специфических для агробактерий аминокислот [2]

Однако эти способы отбора не позволяют использовать селективные среды, что делает процесс отбора длительным и трудоемким.

Известен способ отбора трансформантов, заключающийся в том, что семена высевают на разбавленную вдвое питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую селективный агент антибиотик канамицин [4]

Однако этот способ не позволяет проводить отбор на ранних этапах развития растения зародышах. Кроме того, идентификация трансформантов согласно данному способу возможна лишь тогда, когда разовьются семядольные листья и произойдет утрата хлорофилла под действием канамицина, что требует значительных затрат времени. К тому же, необходимость дезинфекации семян перед посадкой на селективную среду снижает их всхожесть, что влияет на эффективность оценки трансформантов и создает возможность появления артефактов.

Задача изобретения ускорить процесс получения трансформантов и повысить эффективность отбора.

Поставленная задача решается следующим образом: посев эксплантата осуществляют на питательную среду, содержащую селективный агент канамицин, при этом в качестве эксплантата используют зародыши размером 2,0-2,5 мм, а посев осуществляют на питательную среду HLH [3]

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЮТ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Цветки томата кастрируют и опыляют пыльцой, предварительно обработанной плазмидой, несущей в качестве селектирующего маркера ген устойчивости к антибиотику канамицину. Спустя 18-20 дней по достижению зародышами размера не менее 2,0-2,5 мм, что существенно для их дальнейшего развития нормального прорастания и развития в условиях in vitro, плоды срывают, дезинфицируют, извлекают зародыши и высевают на среду HLH, включающую канамицин в дозе 200 мг/л. Через 7 дней по отсутствию артефактов развития выявляют трансформированные зародыши.

Пример. Исследования проводят на томатах сорта Факел. Цветки кастрируют и опыляют, как указано выше. Через 20 дней половину завязавшихся на растении плодов срывают, дезинфицируют, извлекают 2,0-2,5 мм зародыши и часть их высевают на селективную среду HLH, в состав которой вводят канамицин в количестве 200 мг/л. Данные взаимосвязи размеров зародышей с процентом их прорастания представлены в табл. 1. Вторую часть зародышей высевают на среду Мурасиге-Скуга, дополненную канамицином. Обоснование выбора среды HLH представлено в табл. 2.

Спустя семь дней по нормальному прорастанию и развитию зародышей, т.е. по отсутствию некрозов либо других аномалий развития на селективной среде HLH, выявляют среди них трансформанты. На селективной среде Мурасиге-Скуга зародыши не прорастают и не развиваются.

Для получения сравнительных данных вторую половину плодов сохраняют на растении до созревания семян, которое завершается на 42-43 день с момента опыления. Собранные семена дезинфицируют и высевают на селективную HLH среду с канамицином и на селективную среду Мурасиге-Скуга, и содержащую канамицин. Через 10-14 дней выявляют трансформанты по сохранению зеленой окраски семядольных листьев. Полученные данные представлены в табл. 3.

Основные отличия предлагаемого способа от прототипа представлены в табл. 4.

Из данных, представленных в табл. 1, видно, что максимальное прорастание зародышей наблюдается при размере зародыша не менее 2,0-2,5 мм, т.е. показатель размер зародыша является более точным и более информативным, чем возраст зародыша, поскольку при этом не наблюдается сортовой специфичности. Использование зародышей, больших чем 2,0-2,5 мм, т.е. более позднего возраста развития, не имеет смысла, поскольку задача способа ускорение процесса получения трансформантов.

Из данных табл. 2 видно, что среда HLH выбрана с учетом того, что содержит повышенное количество солей, витаминов и сахарозы, т.е. как наиболее оптимальная среда для нормального (без отклонений) прорастания и развития зародышей.

Из данных, представленных в табл. 3, видно, что использование питательной среды HLH с добавкой канамицина позволяет осуществить нормальное развитие только трансформированным, т. е. устойчивым к селектирующему агенту канамицину, зародышам.

Сопоставительный анализ заявленного решения с прототипом показывает, что заявленный способ отличается от известного тем, что в качестве эксплантата используют зародыши определенного размера 2,0-2,5 мм, а посадку эксплантата осуществляют на питательную среду HLH. Данные существенные отличия предлагаемого способа отбора трансформантов томата позволяют обеспечить по сравнению с известным следующие преимущества:

создается возможность выявить трансформанты на более ранних этапах развития растения (зародышах), что сокращает время оценки и ускоряет селекционный процесс;

зародыши по сравнению с семенами более чувствительны к действию селективного агента;

исключается возможность токсичного действия дезинфицирующих веществ на трансформанты, т.к. стерилизуют целый плод, стенки которого надежно защищают зародыши;

использование культуры изолированных зародышей позволяет полностью исследовать завязавшиеся зародыши (включая те, что не смогли по каким-либо причинам полностью созреть) в плодах и дает возможность тем самым увеличить выход трансформантов.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

СПОСОБ ОТБОРА ТРАНСФОРМАНТОВ ТОМАТА, включающий выращивание эксплантов на селективной питательной среде в присутствии канамицина, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют зародыши размером 2,0 2,5 мм, а в качестве питательной среды среду HLH.

Версия для печати
Дата публикации 08.03.2007гг

НОВЫЕ СТАТЬИ И ПУБЛИКАЦИИ
	Технология изготовления универсальных муфт для бесварочного, безрезьбового, бесфлянцевого соединения отрезков труб в трубопроводах высокого давления (имеется видео)
	Технология очистки нефти и нефтепродуктов
	О возможности перемещения замкнутой механической системы за счёт внутренних сил
	Свечение жидкости в тонких диэлектрических каналох
	Взаимосвязь между квантовой и классической механикой
	Миллиметровые волны в медицине. Новый взгляд. ММВ терапия
	Магнитный двигатель
	Источник тепла на базе нососных агрегатов